黑曲霉GZUF36脂肪酶的结构与功能研究

发布时间：2021-03-03 12:16

　　脂肪酶是重要的工业酶之一,其来源、种类、结构和催化反应多种多样,因而广泛地用于食品、医药和新能源开发等领域。黑曲霉脂肪酶是使用最早的脂肪酶之一。然而,黑曲霉脂肪酶晶体结构未知,对其性质的结构基础还不清楚。因此,本文利用黑曲霉GZUF36菌株,逆转录PCR扩增得到一条黑曲霉GZUF36sn-1,3选择性胞外脂肪酶（EXANL1）基因,该基因分别在大肠杆菌和毕赤酵母表达,分别对其表达重组酶分离纯化和酶学性质进行深入研究,基于同源建模和小角X射线散射对毕赤酵母表达重组酶进行结构分析,这些为EXANL1进一步晶体结构解析和分子改造提供借鉴和指导。主要研究内容和结果如下:（1）EXANL1在大肠杆菌中的克隆表达、纯化及其酶学性质表征根据NCBI数据库报道的黑曲霉脂肪酶基因序列（GenBank ID:KJ703109.1）,设计引物,逆转录PCR扩增得到EXANL1的编码蛋白序列,全长894 bp。生物信息学分析EXANL1基因与其他黑曲霉脂肪酶的基因序列相似性在90%以上,编码297个氨基酸,存在57 bp信号肽序列,预测蛋白成熟肽（278个氨基酸）与黑曲霉F044,黑曲霉CBE 332.1,黑... 

【文章来源】：贵州大学贵州省 211工程院校

【文章页数】：115 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 脂肪酶概述
        1.1.1 脂肪酶的结构特征
        1.1.2 脂肪酶的催化机理
        1.1.3 脂肪酶的来源
        1.1.4 黑曲霉脂肪酶
    1.2 蛋白质分离纯化
    1.3 小角X射线溶液散射在生物大分子结构解析中的应用
    1.4 蛋白质模拟理论
        1.4.1 同源建模
        1.4.2 分子对接
    1.5 立题背景与主要研究内容
        1.5.1 立题背景及意义
        1.5.2 主要研究内容
第二章 黑曲霉GZUF36 sn-1,3 胞外脂肪酶EXANL1 在大肠杆菌的表达、纯化及酶学性质表征
    2.1 材料
        2.1.1 主要试剂
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 菌株和质粒
        2.1.4 培养基
        2.1.5 相关溶液的配制
    2.2 方法
        2.2.1 黑曲霉GZUF36 培养及RNA提取样品前处理
        2.2.2 黑曲霉GZUF36总RNA的提取
        2.2.3 黑曲霉GZUF36 脂肪酶c DNA的 RT-PCR
        2.2.4 PCR产物纯化和回收
        2.2.5 琼脂糖凝胶核酸电泳
        2.2.6 黑曲霉GZUF36 脂肪酶EXANL1的c DNA基因测序
        2.2.7 黑曲霉GZUF36 脂肪酶EXANL1 的生物信息学分析
        2.2.8 EXANL1的大肠杆菌工程菌构建
        2.2.9 重组EXANL1的可溶性诱导表达
        2.2.10 重组EXANL1的纯化
        2.2.11 SDS-PAGE分析蛋白纯度
        2.2.12 蛋白浓度的测定
        2.2.13 EXANL1脂肪酶活力的测定
        2.2.14 重组EXANL1最适温度和温度稳定性的测定
        2.2.15 重组EXANL1 最适p H和 p H稳定性的测定
        2.2.16 位置选择性分析
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 RT-PCR克隆EXANL1
        2.3.2 EXANL1的生物信息学分析
        2.3.3 Sn-1,3胞外脂肪酶在大肠杆菌中的表达和纯化
        2.3.4 重组黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶的最适温度和温度稳定性
        2.3.5 重组黑曲霉GZUF36 胞外脂肪酶的最适p H和 p H稳定性
        2.3.6 重组酶位置特异性分析
        2.3.7 重组黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶与黑曲霉F044脂肪酶性质差异分析
    2.4 本章小结
第三章 EXANL1的高活性表达及其酶学性质研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 试验材料
        3.1.2 仪器与设备
        3.1.3 构建重组菌株
        3.1.4 EXANL1的诱导表达
        3.1.5 重组EXANL1的纯化
        3.1.6 糖基化分析
        3.1.7 重组EXANL1的酶学性质
        3.1.8 蛋白含量的测定
        3.1.9 脂肪酶酶活分析
        3.1.10 数据分析
    3.2 结果与讨论
        3.2.1 构建重组菌株
        3.2.2 重组EXANL1的表达与纯化
        3.2.3 糖基化分析
        3.2.4 重组EXANL1的生化表征
    3.3 本章小结
第四章 基于同源建模和小角X射线散射对黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶的结构表征
    4.1 材料与方法
        4.1.1 序列搜索
        4.1.2 二级结构分析
        4.1.3 同源建模
        4.1.4 模型精炼和质量评估
        4.1.5 p EXANL1 的分子对接研究
        4.1.6 p EXANL1 的纯化,样品制备和SAXS分析
    4.2 结果与讨论
        4.2.1 序列比对
        4.2.2 二级结构分析
        4.2.3 p EXANL1 同源建模和模型评价
        4.2.4 p EXANL1 的结构分析
        4.2.5 p EXANL1 的分子对接研究
        4.2.6 p EXANL1 蛋白纯度分析
        4.2.7 SAXS分析p EXANL1 的低分辨结构
    4.3 本章小结
第五章 结论与展望
    5.1 主要结论
    5.2 展望
    5.3 本论文的创新点
致谢
参考文献
附录
图版


【参考文献】：
期刊论文
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[3]毕赤酵母表达系统中启动元件的研究进展[J]. 蒋慧慧.  巢湖学院学报. 2017(03)
[4]组氨酸标签蛋白纯化介质的合成及应用[J]. 华伟伟,徐维元,黄建颖,杨利军.  中国食品学报. 2016(10)
[5]一株黑曲霉creA基因的克隆与序列分析[J]. 孙海彦,黎娟华,刘恩世,易小平,杨景豪,彭明.  食品研究与开发. 2016(18)
[6]脂肪酶产生菌的筛选及其产酶条件优化[J]. 周换景,何腊平,张义明,段税优,李翠芹,李兰香,夏朝双,王欢,田辉.  酿酒科技. 2014(01)
[7]从头预测蛋白质骨架的一种并行蚁群方法及其在CASP8/9中的应用[J]. 吴宏杰,吕强,吴进珍,黄旭,罗小虎,钱培德.  中国科学:信息科学. 2012(08)
[8]黑曲霉F044脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究[J]. 舒正玉,杨江科,闫云君.  生物工程学报. 2007(01)
[9]脂肪酶催化合成生物柴油的研究[J]. 邓利,谭天伟,王芳.  生物工程学报. 2003(01)
[10]脂肪酶基因结构和氨基酸序列的比较[J]. 邬敏辰.  江南学院学报. 2001(02)

博士论文
[1]黑曲霉脂肪酶的酶学性质、基因克隆与表达及结构预测[D]. 舒正玉.华中科技大学 2007



本文编号：3061247