鸭蛋卵清蛋白抗氧化肽和免疫调节活性肽的制备

发布时间：2022-07-03 16:19

　　鸭蛋蛋清蛋白属于全价蛋白质,含有人体必需氨基酸、钙、维生素以及微量矿物质元素。但我国工业生产中,鸭蛋蛋清的利用较少,造成了资源浪费和环境污染。卵清蛋白是蛋清中最主要的蛋白质,含量为56%,研究其应用价值有助于鸭蛋蛋清的高值化利用。而生物活性肽在食品和医药领域展现了巨大的应用潜力,从酶解物中分离制备活性肽,成为各种植物和动物蛋白质高值化利用的重要途径之一。因此本文以鸭蛋蛋清为原料,提取其中的卵清蛋白,蛋白酶酶解后再进行分离纯化、多肽序列鉴定,并使用体外抗氧化模型和RAW 264.7细胞模型评估其抗氧化活性和免疫调节活性,实验结果如下:本研究比较了p H 4.5、60%饱和硫酸铵沉淀法、p H 9.0、60%饱和硫酸铵沉淀法、PEG 4000分离法三种提取卵清蛋白的工艺,发现采用p H 4.50、60%饱和硫酸铵沉淀法获得的蛋白总氮含量为86.75%、蛋白得率为85.32%。圆二色谱法预测其二级结构为:α-螺旋15.06%、β-折叠24.69%、β-转角25.63%、无规则卷曲33.83%。此外,1000μg/m L样品刺激下,RAW 264.7细胞上清液中NO、TNF-α、IL-6的分泌... 

【文章页数】：88 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 鸭蛋蛋清的组成及其特点
    1.2 卵清蛋白的研究现状
        1.2.1 卵清蛋白简介
        1.2.2 卵清蛋白的应用价值
            1.2.2.1 营养价值和医用价值
            1.2.2.2 理化性质及其应用
        1.2.3 卵清蛋白的提取方法
        1.2.4 卵清蛋白肽的生物活性
            1.2.4.1 抗菌活性
            1.2.4.2 抗氧化活性
            1.2.4.3 免疫活性肽
            1.2.4.4 其他活性
        1.2.5 鸭蛋卵清蛋白的研究现状
    1.3 本课题研究的立题依据和主要研究内容
        1.3.1 立题依据
        1.3.2 主要研究内容
第二章 鸭蛋卵清蛋白的提取及其二级结构和功能活性的研究
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 试剂
        2.2.3 主要仪器与设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 鸭蛋中卵清蛋白的提取
        2.3.2 鸭蛋卵清蛋白中蛋白质含量的测定及得率的计算
        2.3.3 提取的鸭蛋卵清蛋白分子量测定
        2.3.4 鸭蛋卵清蛋白的氨基酸组成
        2.3.5 鸭蛋卵清蛋白的二级结构分析
            2.3.5.1 红外光谱分析
            2.3.5.2 圆二色谱分析
            2.3.5.3 扫描电镜分析
        2.3.6 鸭蛋卵清蛋白的免疫调节活性评价
        2.3.7 鸭蛋卵清蛋白的抗氧化活性评价
            2.3.7.1 DPPH自由基清除能力
            2.3.7.2 ABTS~+·自由基清除能力
            2.3.7.3 ORAC法测定样品抗氧化能力
        2.3.8 数据处理
    2.4 结果与分析
        2.4.1 鸭蛋卵清蛋白的蛋白含量分析
        2.4.2 鸭蛋卵清蛋白分子量和纯度测定
        2.4.3 鸭蛋卵清蛋白的氨基酸组成比较
        2.4.4 鸭蛋卵清蛋白的二级结构分析
            2.4.4.1 鸭蛋卵清蛋白的傅里叶红外光谱分析
            2.4.4.2 鸭蛋卵清蛋白的圆二色谱分析
            2.4.4.3 鸭蛋卵清蛋白的扫描电镜分析
        2.4.5 鸭蛋卵清蛋白的免疫调节活性分析
        2.4.6 蛋白的抗氧化活性评价
    2.5 本章小结
第三章 鸭蛋卵清蛋白的酶解及其产物抗氧化活性、免疫调节活性的研究
    3.1 前言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 试剂
        3.2.3 仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 蛋白酶酶活的测定
        3.3.2 水解度的测定
        3.3.3 水解酶的筛选
        3.3.4 单因素实验设计
            3.3.4.1 最佳酶解时间的筛选
            3.3.4.2 加酶量的筛选
            3.3.4.3 酶解温度的筛选
            3.3.4.4 酶解pH的筛选
        3.3.5 正交试验设计
        3.3.6 HD分子量的测定
        3.3.7 HD的免疫调节活性评价
        3.3.8 HD对 AAPH诱导的红细胞溶血的保护作用
        3.3.9 HD的体外抗氧化活性评价
            3.3.9.1 DPPH自由基清除能力
            3.3.9.2 ABTS~+·自由基清除能力
            3.3.9.3 ORAC法测定样品体外抗氧化能力
        3.3.10 数据处理
    3.4 结果与分析
        3.4.1 不同蛋白酶的酶活测定
        3.4.2 五种水解酶的筛选
        3.4.3 单因素实验结果
            3.4.3.1 酶解时间的筛选
            3.4.3.2 加酶量的筛选
            3.4.3.3 酶解温度的筛选
            3.4.3.4 酶解pH的筛选
        3.4.4 正交实验结果与分析
        3.4.5 HD的分子量分布
        3.4.6 HD的免疫调节活性评价
        3.4.7 HD对 AAPH诱导的红细胞溶血的保护作用
        3.4.8 HD的体外抗氧化活性评价
    3.5 本章小结
第四章 鸭蛋卵清蛋白酶解物中抗氧化和免疫调节活性肽的分离与鉴定
    4.1 前言
    4.2 材料与设备
        4.2.1 材料
        4.2.2 主要试剂
        4.2.3 主要仪器与设备
    4.3 实验方法
        4.3.1 鸭蛋卵清蛋白多肽的分离纯化
            4.3.1.1 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱纯化多肽
            4.3.1.2 Sephadex G-15分离纯化
        4.3.2 HPLC-MS/MS分析
        4.3.3 反向合成多肽
        4.3.4 免疫调节活性评价
            4.3.4.1 细胞存活率
            4.3.4.2 NO和细胞因子的测定
        4.3.5 抗氧化活性评价
            4.3.5.1 DPPH自由基清除能力
            4.3.5.2 ABTS~+·自由基清除能力
            4.3.5.3 ORAC法测定样品抗氧化能力
            4.3.5.4 红细胞溶血
    4.4 结果与分析
        4.4.1 DEAE Sepharose F F阴离子交换柱分离纯化
        4.4.2 DEAE Sepharose F F阴离子柱洗脱组分的免疫调节活性研究
            4.4.2.1 细胞存活率
            4.4.2.2 DEAE Sepharose F F阴离子柱组分免疫调节活性
            4.4.2.3 DEAE Sepharose F F阴离子柱洗脱组分的抗氧化活性比较
            4.4.2.4 DEAE Sepharose F F阴离子柱洗脱组分对红细胞溶血抑制作用
        4.4.3 Sephadex G-15 凝胶柱分离纯化
        4.4.4 Sephadex G-15 洗脱组分的活性探究
            4.4.4.1 HD-1的免疫调节活性
            4.4.4.2 HD-1的抗氧化活性研究
            4.4.4.3 HD-1的红细胞溶血抑制作用
        4.4.5 Sephadex G-15 洗脱组分的LC-MS/MS分析
        4.4.6 合成多肽的活性研究
            4.4.6.1 合成多肽的免疫调节活性研究
            4.4.6.2 合成多肽的抗氧化活性研究
    4.5 本章小结
结论与展望
参考文献
附录
攻读硕士学位期间取得的研究成果
致谢
附件


【参考文献】：
期刊论文
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[10]鸭蛋清蛋白肽的酶法制备及其抗氧化活性研究[D]. 任尧.华南理工大学 2011



本文编号：3655216