阪崎克罗诺杆菌活菌快速检测技术研究

发布时间：2022-08-04 16:47

　　食品安全问题是一个全球性的公共卫生安全问题,一直都是社会关注的焦点,因为这关系着每个人的切身利益,而其中,由食源性致病菌引起的食品安全问题更是日前人们最为关注的点。因为食源性致病菌具有很大危害性且很大地影响食品污染,因此,建立快速、便捷、灵敏的食源性致病菌检测方法对预防食品安全问题以及保护人类健康问题具有很重要意义。阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一种食源性条件致病菌,会引起一系列病症,其中包括败血症、坏死性结肠炎以及新生儿脑膜炎。该菌可存在于牛奶、蔬菜、肉类和茶等各种食物内,但婴幼儿配方奶粉（powdered infant formula,PIF）是其最主要的污染源。由于阪崎肠杆菌对新生儿具有巨大的潜在风险,已被FAO-WHO正式确认为A类病原体。本论文基于阪崎克罗诺杆菌的特异序列及特异性结构构建了四种阪崎克罗诺杆菌活菌的快速检测方法,简述如下:1)建立了基于逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcriptase–Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）核酶的阪崎克罗诺杆菌活菌的电化学检测方法。在该研究中,首先对阪崎克... 

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摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 课题来源
    1.2 课题研究的目的和意义
    1.3 课题研究背景
        1.3.1 阪崎克罗诺杆菌简介
        1.3.2 阪崎克罗诺杆菌的生理生化特性
        1.3.3 污染源
        1.3.4 阪崎克罗诺杆菌检测方法的国内外概况
        1.3.5 G-四链体/hemin核酶
    1.4 活菌检测技术研究进展
        1.4.1 检测靶标的选择
        1.4.2 DNA结合染料
        1.4.3 核酸适配体
    1.5 论文的主要研究内容
第二章 基于RT-PCR偶联DNAzyme的阪崎克罗诺杆菌活菌的电化学检测技术
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 菌株及实验试剂
        2.2.2 试剂配制
        2.2.3 主要仪器设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 阪崎克罗诺杆菌活菌电化学检测方法
        2.3.2 细菌的培养与计数
        2.3.3 RNA提取
        2.3.4 引物设计
        2.3.5 RT-PCR反应引物设计
        2.3.6 电化学检测
        2.3.7 Hemin浓度的优化
        2.3.8 底物的优化
        2.3.9 电化学检测的特异性评价
        2.3.10 电化学检测的灵敏度测定
        2.3.11 人工污染样品检测
    2.4 结果分析
        2.4.1 阪崎克罗诺杆菌电化学检测方法可行性验证
        2.4.2 实验条件的优化
        2.4.3 电化学检测的特异性评价
        2.4.4 电化学检测的灵敏度测定
        2.4.5 人工污染样品检测结果
    2.5 讨论
    2.6 本章小结
第三章 基于LAMP和PMA的阪崎克罗诺杆菌活菌的可视化检测技术
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 菌株及实验试剂
        3.2.2 试剂配制
        3.2.3 主要仪器设备
    3.3 实验方法
        3.3.1 基于LAMP与PMA的可视化检测方法原理
        3.3.2 菌液的制备
        3.3.3 菌落裂解
        3.3.4 LAMP引物设计
        3.3.5 PMA处理
        3.3.6 LAMP反应
        3.3.7 实验条件的优化
        3.3.8 基于LAMP-PMA可视化检测特异性评价
        3.3.9 基于LAMP-PMA可视化检测灵敏度测定
        3.3.10 人工污染样品检测
    3.4 结果与分析
        3.4.1 最佳反应条件的确定
        3.4.2 基于LAMP-PMA可视化检测特异性评价
        3.4.3 基于LAMP-PMA可视化检测灵敏度测定
        3.4.4 人工污染样品检测结果
    3.5 讨论
    3.6 本章小结
第四章 基于RT-PSR的阪崎克罗诺杆菌活菌的可视化检测技术
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 菌株及实验试剂
        4.2.2 试剂配制
        4.2.3 主要仪器设备
    4.3 实验方法
        4.3.1 基于RT-PSR可视化检测方法原理
        4.3.2 细菌的培养与计数
        4.3.3 RNA提取
        4.3.4 引物设计
        4.3.5 可视化检测
        4.3.6 实验条件的优化
        4.3.7 基于RT-PSR可视化检测的特异性评价
        4.3.8 基于RT-PSR可视化检测的灵敏度测定
        4.3.9 人工污染样品检测
    4.4 结果分析
        4.4.1 RT-PSR可视化检测反应温度的优化
        4.4.2 RT-PSR可视化检测反应时间的优化
        4.4.3 d NTP浓度的优化
        4.4.4 基于RT-PSR可视化检测特异性评价
        4.4.5 基于RT-PSR可视化检测灵敏度测定
        4.4.6 人工污染样品检测结果
    4.5 讨论
    4.6 本章小结
第五章 基于适配体偶联DNAzyme的阪崎克罗诺杆菌活菌的可视化检测技术
    5.1 引言
    5.2 实验材料
        5.2.1 菌株及实验试剂
        5.2.2 试剂配制
        5.2.3 主要仪器设备
    5.3 实验方法
        5.3.1 基于适配体-DNAzyme的阪崎克罗诺杆菌无酶可视化检测原理
        5.3.2 细菌的培养与计数
        5.3.3 引物设计
        5.3.4 可视化检测
        5.3.5 Hemin浓度的优化
        5.3.6 温育温度的优化
        5.3.7 可视化检测特异性评价
        5.3.8 可视化检测灵敏度测定
        5.3.9 人工污染样品检测
    5.4 结果和分析
        5.4.1 阪崎克罗诺杆菌可视化检测可行性分析
        5.4.2 实验条件的优化
        5.4.3 可视化检测特异性评价
        5.4.4 可视化检测灵敏度测定
        5.4.5 人工污染样品检测结果
    5.5 讨论
    5.6 本章小结
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]环介导等温扩增-无电加热法检测乳中阪崎克罗诺杆菌[J]. 付世骞,曲艳艳,冯晓涵,满朝新,姜毓君.  食品与发酵工业. 2018(03)
[2]2001-2013年中国重大食物中毒事件的分析评价[J]. 杜苏萍,王敬敬,张昭寰,孙晓红,潘迎捷,赵勇.  上海海洋大学学报. 2016(02)
[3]阪崎克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术研究[J]. 黄焘,周蒂,王莉萍.  环境与职业医学. 2013(11)
[4]基于rpoB基因的阪崎克罗诺杆菌分子检测体系的建立及其应用[J]. 周胜利,黄佳,晁爱敏,于海燕,顾卿,韩明春,徐杭英,周斌.  安全与环境学报. 2012(04)
[5]阪崎肠杆菌及与肠杆菌科其他细菌差异比较[J]. 高建新,傅松哲,龙慧,肖菊珍.  中国乳品工业. 2011(02)
[6]浅谈生物安全实验室及其在质量监督检验检疫领域中的应用[J]. 姜雯,薛巍,王庆贵.  中国标准化. 2006(09)

硕士论文
[1]基于核酸适配体的赭曲霉毒素A和伏马毒素B1检测方法研究[D]. 桂海娈.浙江农林大学 2015



本文编号：3669909