副溶血性弧菌风险评估关键技术及重要毒力蛋白VopA结晶条件筛选的研究
发布时间：2022-12-10 12:04
中国是水产品生产与消费的大国,研究数据显示,2001年至今,我国的水产品生产与消费均在逐年递增,生产与消费量常年位于世界第一。副溶血性弧菌是水产品中最为常见的食源性致病菌,严重威胁着水产品质量与安全,制约着水产行业的健康可持续发展。微生物风险评估是控制水产品中副溶血性弧菌危害的重要手段和工具,可有效控制副溶血性弧菌的潜在风险。本文针对副溶血性弧菌风险评估中危害识别、暴露评估、危害特征描述这3大核心部分的缺陷与不足展开攻关,进行了基于活菌DNA的副溶血性弧菌危害识别新技术研究、基于概率分布构建副溶血性弧菌暴露评估中描述细菌生长速率和浓度的随机模型研究、以及副溶血性弧菌关键危害特征的毒力蛋白VopA晶体学的初步研究。主要研究内容和研究结果如下:1.基于活菌DNA的副溶血性弧菌危害识别新技术研究传统副溶血性弧菌危害识别技术较少关注水产品中死活菌的问题,常把死活菌的数量共同计算入风险评估中,导致其患病风险的错误估计,造成了副溶血性弧菌风险评估的不确定性。为了更准确地识别副溶血性弧菌的实际危害,亟需发展一套基于活菌DNA的副溶血性弧菌危害识别新技术,用以正确评估副溶血性弧菌的真实风险。叠氮溴化丙...
【文章页数】：131 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩写词表
第一章 文献综述 水产品中副溶血性弧菌风险评估研究现状及展望
1.1 中国水产品生产与消费现状
1.2 水产品中常见食源性致病菌
1.3 副溶血性弧菌风险评估研究现状
1.3.1 国外副溶血性弧菌风险评估研究现状
1.3.2 国内副溶血性弧菌风险评估研究现状
1.4 副溶血性弧菌风险评估三大核心步骤的研究现状与展望
1.5 副溶血性弧菌危害识别技术的研究现状与展望
1.5.1 平板计数法
1.5.2 最大或然数方法
1.5.3 免疫试纸条
1.5.4 基于RNA的检测方法
1.5.5 qPCR活菌定量方法
1.5.6 副溶血性弧菌危害识别技术研究的展望
1.6 副溶血性弧菌暴露评估模型的研究现状与展望
1.6.1 预测微生物学研究进展
1.6.2 副溶血性弧菌预测微生物学研究进展与展望
1.6.3 应用概率分布描述副溶血性弧菌浓度的研究现状与展望
1.7 副溶血性弧菌危害特征描述的研究现状与展望
1.7.1 副溶血性弧菌致病性相关毒力蛋白结构生物学研究现状
1.7.1.1 耐热直接溶血素蛋白(TDH)
1.7.1.2 幼虾急性肝胰腺坏死病致病蛋白pirA/B
1.7.1.3 三型分泌系统结构蛋白VtrA/VtrB/VtrC
1.7.1.4 三型分泌系统效应蛋白VopL
1.7.2 副溶血性弧菌致病性相关毒力蛋白结构生物学展望
1.7.2.1 耐热相关溶血素蛋白(TRH)
1.7.2.2 三型分泌系统(T3SS)及其效应物蛋白(T3SE)
1.7.2.3 外膜生物合成转运系统
1.8 本课题的研究方案
参考文献
第二章 基于活菌DNA的副溶血性弧菌危害识别新技术研究
2.1 引言
2.2 实验材料与方法
2.2.1 实验材料
2.2.2 副溶血性弧菌和霍乱弧菌菌株
2.2.3 活菌DNA快速筛选仪器的设计图
2.2.4 基于活菌DNA筛选仪器的PMA前处理过程
2.2.5 引物、探针及PCR反应条件
2.2.6 PMA两重qPCR技术的特异性分析
2.2.7 PMA两重qPCR技术标准曲线的构建
2.2.8 致病性弧菌死菌的制备
2.2.9 PMA两重qPCR在人工接种样品中的应用
2.2.10 PMA两重qPCR在实际水产样品中的应用
2.3 结果与讨论
2.3.1 活菌DNA快速筛选仪器的构建
2.3.2 PMA两重qPCR的特异性分析
2.3.3 PMA两重qPCR的扩增效率
2.3.4 PMA两重qPCR最低定量限
2.3.5 PMA两重qPCR在人工接种样本中区分死活菌的研究
2.3.6 PMA两重qPCR在实际水产样本中的应用
2.4 本章小结
参考文献
第三章 基于概率分布构建副溶血性弧菌暴露评估中描述细菌生长速率和浓度的随机模型研究
第一节 南美白对虾中副溶血性弧菌随机预测生长模型的研究
3.1.1 引言
3.1.2 材料与方法
3.1.2.1 副溶血性弧菌菌株生长信息的收集
3.1.2.2 南美白对虾中副溶血性弧菌生长数据的整合及二级模型的构建及验证
3.1.2.3 南美白对虾中副溶血性弧菌随机预测生长模型的构建
3.1.3 结果与分析
3.1.3.1 副溶血性弧菌生长特性信息库构建
3.1.3.2 副溶血性弧菌最大比生长速率二级模型的构建与验证
3.1.3.3 副溶血性弧菌最大比生长速率的随机预测模型
3.1.4 讨论
3.1.5 小结
第二节 水产品中副溶血性弧菌污染量描述的概率评估模型研究
3.2.1 引言
3.2.2 材料与方法
3.2.2.1 样品采集
3.2.2.2 MPN-PCR法
3.2.2.3 统计分析
3.2.2.4 使用概率分布描述细菌污染
3.2.3 结果和讨论
3.2.3.1 上海市大型超市水产品中副溶血性弧菌的污染情况分析
3.2.3.2 最适概率分布的选择
3.2.4 小结
参考文献
第四章 副溶血性弧菌危害特征关键毒力蛋白VopA表达纯化与结晶条件的筛选
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 材料与试剂
4.2.2 VopA蛋白的生物信息学分析
4.2.3 6His-MBP-TEV-VopA重组表达载体的构建
4.2.4 6His-TEV-VopA重组表达载体的构建
4.2.5 VopA重组蛋白的诱导表达
4.2.6 VopA重组蛋白的提取
4.2.7 VopA重组蛋白的纯化
4.2.8 Tev酶切及VopA重组蛋白的二次纯化
4.2.9 VopA蛋白结晶条件的筛选
4.3 结果与讨论
4.3.1 VopA蛋白的生物信息学分析结果
4.3.1.1 VopA蛋白理化性质分析
4.3.1.2 VopA蛋白信号肽与跨膜区域预测与分析
4.3.1.3 VopA蛋白的二级结构预测与分析
4.3.1.4 VopA蛋白的三级结构预测与分析
4.3.2 VopA表达载体构建结果
4.3.3 6His-MBP-Tev-VopA重组蛋白的表达与纯化
4.3.4 6His-Tev-VopA重组蛋白的表达与纯化
4.3.5 6His-Tev-VopA重组蛋白的大规模制备
4.3.6 VopA蛋白结晶条件的筛选
4.4 本章小结
参考文献
全文总结
本研究不足与展望
附录
在上海海洋大学就读博士期间取得的科研成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]酸性电解水对副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌杀菌效果的比较研究[J]. 许愈,赵莉,刘海泉,潘迎捷,赵勇. 食品安全质量检测学报. 2018(16)
[2]熟食品消费的网络评论对线上销量的影响研究——以水禽熟食产品为例[J]. 刘灵芝,胡天娇,肖邦明. 中国农业大学学报. 2018(05)
[3]一起食源性食物中毒事件病原的检测与溯源[J]. 许金凤,徐虹,茅凌翔,徐岚,张潇丹,郑东宇. 江苏预防医学. 2016(05)
[4]分子生物学技术在预测微生物学中的应用与展望[J]. 张昭寰,娄阳,杜苏萍,潘迎捷,赵勇. 食品科学. 2017(09)
[5]市售水产品中副溶血性弧菌污染的定量风险评估[J]. 王李伟,张昭寰,赵勇,彭少杰. 上海预防医学. 2016(06)
[6]食源性致病菌单细胞观测与预测的研究进展[J]. 董庆利,刘阳泰,苏亮,王忻,刘箐,丁甜. 农业机械学报. 2015(11)
[7]多重与单一耐药的副溶血性弧菌在纯培养及南美白对虾中生长动力学的参数比较研究[J]. 娄阳,张昭寰,肖莉莉,郭丹凤,刘海泉,潘迎捷,赵勇. 现代食品科技. 2015(05)
[8]近10年来我国水产品供求变化及趋势分析[J]. 孙炜琳,刘佩. 农产品市场周刊. 2015(12)
[9]运用Real-time PCR建立即食虾中副溶血性弧菌分子预测模型[J]. 孙文烁,靳梦曈,王敬敬,张昭寰,孙晓红,潘迎捷,赵勇. 现代食品科技. 2014(07)
[10]基于反转录实时荧光定量PCR的3种标准曲线定量活副溶血性弧菌的差值分析[J]. 靳梦曈,孙文烁,李沁,孙晓红,潘迎捷,赵勇. 微生物学报. 2014(04)
博士论文
[1]生食贝类中副溶血性弧菌污染水平调查、定量风险评估和分离菌株特征分析[D]. 韩海红.中国疾病预防控制中心 2015
[2]水产品中副溶血性弧菌风险评估基础研究[D]. 唐晓阳.上海海洋大学 2013
硕士论文
[1]南美白对虾中常见食源性致病菌快速检测技术及分子预测微生物模型的构建[D]. 张昭寰.上海海洋大学 2015
[2]杂色蛤中副溶血性弧菌的定量风险评估[D]. 吴英娇.福建农林大学 2011
[3]大功率蓝光LED可靠性与失效分析[D]. 吴帆.华中科技大学 2007
本文编号：3716715
【文章页数】：131 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩写词表
第一章 文献综述 水产品中副溶血性弧菌风险评估研究现状及展望
1.1 中国水产品生产与消费现状
1.2 水产品中常见食源性致病菌
1.3 副溶血性弧菌风险评估研究现状
1.3.1 国外副溶血性弧菌风险评估研究现状
1.3.2 国内副溶血性弧菌风险评估研究现状
1.4 副溶血性弧菌风险评估三大核心步骤的研究现状与展望
1.5 副溶血性弧菌危害识别技术的研究现状与展望
1.5.1 平板计数法
1.5.2 最大或然数方法
1.5.3 免疫试纸条
1.5.4 基于RNA的检测方法
1.5.5 qPCR活菌定量方法
1.5.6 副溶血性弧菌危害识别技术研究的展望
1.6 副溶血性弧菌暴露评估模型的研究现状与展望
1.6.1 预测微生物学研究进展
1.6.2 副溶血性弧菌预测微生物学研究进展与展望
1.6.3 应用概率分布描述副溶血性弧菌浓度的研究现状与展望
1.7 副溶血性弧菌危害特征描述的研究现状与展望
1.7.1 副溶血性弧菌致病性相关毒力蛋白结构生物学研究现状
1.7.1.1 耐热直接溶血素蛋白(TDH)
1.7.1.2 幼虾急性肝胰腺坏死病致病蛋白pirA/B
1.7.1.3 三型分泌系统结构蛋白VtrA/VtrB/VtrC
1.7.1.4 三型分泌系统效应蛋白VopL
1.7.2 副溶血性弧菌致病性相关毒力蛋白结构生物学展望
1.7.2.1 耐热相关溶血素蛋白(TRH)
1.7.2.2 三型分泌系统(T3SS)及其效应物蛋白(T3SE)
1.7.2.3 外膜生物合成转运系统
1.8 本课题的研究方案
参考文献
第二章 基于活菌DNA的副溶血性弧菌危害识别新技术研究
2.1 引言
2.2 实验材料与方法
2.2.1 实验材料
2.2.2 副溶血性弧菌和霍乱弧菌菌株
2.2.3 活菌DNA快速筛选仪器的设计图
2.2.4 基于活菌DNA筛选仪器的PMA前处理过程
2.2.5 引物、探针及PCR反应条件
2.2.6 PMA两重qPCR技术的特异性分析
2.2.7 PMA两重qPCR技术标准曲线的构建
2.2.8 致病性弧菌死菌的制备
2.2.9 PMA两重qPCR在人工接种样品中的应用
2.2.10 PMA两重qPCR在实际水产样品中的应用
2.3 结果与讨论
2.3.1 活菌DNA快速筛选仪器的构建
2.3.2 PMA两重qPCR的特异性分析
2.3.3 PMA两重qPCR的扩增效率
2.3.4 PMA两重qPCR最低定量限
2.3.5 PMA两重qPCR在人工接种样本中区分死活菌的研究
2.3.6 PMA两重qPCR在实际水产样本中的应用
2.4 本章小结
参考文献
第三章 基于概率分布构建副溶血性弧菌暴露评估中描述细菌生长速率和浓度的随机模型研究
第一节 南美白对虾中副溶血性弧菌随机预测生长模型的研究
3.1.1 引言
3.1.2 材料与方法
3.1.2.1 副溶血性弧菌菌株生长信息的收集
3.1.2.2 南美白对虾中副溶血性弧菌生长数据的整合及二级模型的构建及验证
3.1.2.3 南美白对虾中副溶血性弧菌随机预测生长模型的构建
3.1.3 结果与分析
3.1.3.1 副溶血性弧菌生长特性信息库构建
3.1.3.2 副溶血性弧菌最大比生长速率二级模型的构建与验证
3.1.3.3 副溶血性弧菌最大比生长速率的随机预测模型
3.1.4 讨论
3.1.5 小结
第二节 水产品中副溶血性弧菌污染量描述的概率评估模型研究
3.2.1 引言
3.2.2 材料与方法
3.2.2.1 样品采集
3.2.2.2 MPN-PCR法
3.2.2.3 统计分析
3.2.2.4 使用概率分布描述细菌污染
3.2.3 结果和讨论
3.2.3.1 上海市大型超市水产品中副溶血性弧菌的污染情况分析
3.2.3.2 最适概率分布的选择
3.2.4 小结
参考文献
第四章 副溶血性弧菌危害特征关键毒力蛋白VopA表达纯化与结晶条件的筛选
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 材料与试剂
4.2.2 VopA蛋白的生物信息学分析
4.2.3 6His-MBP-TEV-VopA重组表达载体的构建
4.2.4 6His-TEV-VopA重组表达载体的构建
4.2.5 VopA重组蛋白的诱导表达
4.2.6 VopA重组蛋白的提取
4.2.7 VopA重组蛋白的纯化
4.2.8 Tev酶切及VopA重组蛋白的二次纯化
4.2.9 VopA蛋白结晶条件的筛选
4.3 结果与讨论
4.3.1 VopA蛋白的生物信息学分析结果
4.3.1.1 VopA蛋白理化性质分析
4.3.1.2 VopA蛋白信号肽与跨膜区域预测与分析
4.3.1.3 VopA蛋白的二级结构预测与分析
4.3.1.4 VopA蛋白的三级结构预测与分析
4.3.2 VopA表达载体构建结果
4.3.3 6His-MBP-Tev-VopA重组蛋白的表达与纯化
4.3.4 6His-Tev-VopA重组蛋白的表达与纯化
4.3.5 6His-Tev-VopA重组蛋白的大规模制备
4.3.6 VopA蛋白结晶条件的筛选
4.4 本章小结
参考文献
全文总结
本研究不足与展望
附录
在上海海洋大学就读博士期间取得的科研成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]酸性电解水对副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌杀菌效果的比较研究[J]. 许愈,赵莉,刘海泉,潘迎捷,赵勇. 食品安全质量检测学报. 2018(16)
[2]熟食品消费的网络评论对线上销量的影响研究——以水禽熟食产品为例[J]. 刘灵芝,胡天娇,肖邦明. 中国农业大学学报. 2018(05)
[3]一起食源性食物中毒事件病原的检测与溯源[J]. 许金凤,徐虹,茅凌翔,徐岚,张潇丹,郑东宇. 江苏预防医学. 2016(05)
[4]分子生物学技术在预测微生物学中的应用与展望[J]. 张昭寰,娄阳,杜苏萍,潘迎捷,赵勇. 食品科学. 2017(09)
[5]市售水产品中副溶血性弧菌污染的定量风险评估[J]. 王李伟,张昭寰,赵勇,彭少杰. 上海预防医学. 2016(06)
[6]食源性致病菌单细胞观测与预测的研究进展[J]. 董庆利,刘阳泰,苏亮,王忻,刘箐,丁甜. 农业机械学报. 2015(11)
[7]多重与单一耐药的副溶血性弧菌在纯培养及南美白对虾中生长动力学的参数比较研究[J]. 娄阳,张昭寰,肖莉莉,郭丹凤,刘海泉,潘迎捷,赵勇. 现代食品科技. 2015(05)
[8]近10年来我国水产品供求变化及趋势分析[J]. 孙炜琳,刘佩. 农产品市场周刊. 2015(12)
[9]运用Real-time PCR建立即食虾中副溶血性弧菌分子预测模型[J]. 孙文烁,靳梦曈,王敬敬,张昭寰,孙晓红,潘迎捷,赵勇. 现代食品科技. 2014(07)
[10]基于反转录实时荧光定量PCR的3种标准曲线定量活副溶血性弧菌的差值分析[J]. 靳梦曈,孙文烁,李沁,孙晓红,潘迎捷,赵勇. 微生物学报. 2014(04)
博士论文
[1]生食贝类中副溶血性弧菌污染水平调查、定量风险评估和分离菌株特征分析[D]. 韩海红.中国疾病预防控制中心 2015
[2]水产品中副溶血性弧菌风险评估基础研究[D]. 唐晓阳.上海海洋大学 2013
硕士论文
[1]南美白对虾中常见食源性致病菌快速检测技术及分子预测微生物模型的构建[D]. 张昭寰.上海海洋大学 2015
[2]杂色蛤中副溶血性弧菌的定量风险评估[D]. 吴英娇.福建农林大学 2011
[3]大功率蓝光LED可靠性与失效分析[D]. 吴帆.华中科技大学 2007
本文编号：3716715
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