银杏黄酮合成途径GbDFR家族三个新基因的克隆与功能研究

发布时间：2020-04-01 12:52

【摘要】：二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是参与植物黄酮合成途径下游花青素合成的关键酶。DFR不仅影响植物花和果实的颜色,而且对于植物不同黄酮组分的分配具有一定的调控作用。银杏作为最古老的孑遗植物,具有极高的营养价值和药用价值,尤其对心脑血管疾病的防治有显著的疗效。黄酮类物质是银杏提取物的主要活性成分之一,所以研究银杏黄酮合成途径具有重要的现实意义。本研究以拟南芥At DFR基因为参考,对银杏全基因组序列进行比对,发现了银杏Gb DFR家族的三个新基因并对这三个新基因的功能和特性进行了比较系统的研究。我们首先考查了外源激素和环境刺激对银杏黄酮合成及这三个基因表达的影响,初步分析了三个基因在外界刺激诱发银杏黄酮合成过程中的功能差异;然后分别构建了这三个基因的表达载体,通过注射烟草和拟南芥tt3突变体瞬时表达后的蛋白体外酶活实验初步验证这三个基因的功能;最后通过转化野生型烟草及拟南芥tt3突变体对这三个基因的功能进行进一步的验证。主要研究内容及结果如下:1、根据拟南芥的At DFR基因序列,利用生物信息学技术对银杏全基因组序列进行搜索比对,获得银杏三个基因的序列。通过序列比对分析,我们发现这三个基因与之前报道的三个Gb DFR基因不同,所以将它们分别命名为Gb DFR4、Gb DFR5和Gb DFR6。2、考察了外源施加水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)以及季节变化对银杏黄酮含量以及三个基因表达的影响。结果显示:SA和JA处理都能影响银杏黄酮的含量,不过它们对三个Gb DFR基因的调控比较复杂。另外,从四月份开始,银杏的花青素含量逐月上升,但是三个Gb DFR基因的表达量却逐月下降。3、克隆了这三个Gb DFR基因,构建了它们的35S超表达载体。4、通过注射烟草和拟南芥tt3突变体的叶片对Gb DFR蛋白进行瞬时表达,并对提取的蛋白进行体外酶活实验分析。结果显示,三个基因编码的蛋白在体外都具有DFR的酶活性。5、用叶盘法将三个Gb DFR基因的表达载体分别转入野生型烟草中,考察外源基因的表达对烟草花色及花青素含量的影响。结果显示,转基因烟草的花青素含量比野生型更高,花的颜色更深。6、通过花序侵染法将三个Gb DFR基因转化拟南芥tt3突变体进行功能回复实验,在刚刚获得的转基因阳性苗中观察到了多个生长点,推测与生长素运输有关。综上所述,本论文实验结果初步证明这三个基因能够行使DFR基因的功能,具有二氢黄酮醇4-还原酶活性。
【图文】：

花青素苷,催化合成,还原酶

图 1.1 二氢黄酮醇 4-还原酶催化合成花青素苷Figure 1.1 Anthocyanins catalytic synthesis by dihydroflavonol 4-reducta当前经济全球化的发展趋势，人们的饮食文化也日渐多样化简单的温饱等生理的基本需求，而是追求更高的精神上的味费者需求，各种食品加工方式花样百出，由此而来的各种安球关注的焦点。花青素因其独特的抗氧化性，且作为一种安着色剂，在社会中广泛利用，，需求日益增大。近年来花青素够促进健康的特性和生态意义引起了广大植物学家的极大兴获得了诸多研究成果，但仍然无法满足巨大的市场需求，因存在无限的发展潜力[56]。 DFR 基因的特征及功能研究物 DFR 基因的结构特征

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技术路线图
【学位授予单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2;S792.95

【参考文献】