嗜热毛壳菌多糖单加氧酶的性质及协同作用研究

发布时间：2020-04-03 03:09

【摘要】：目前所开采利用的大多数能源属于不可再生能源,终究会开采殆尽。纤维素生物质因其丰富可再生的特点提供了成为替代能源的可能,纤维素生物质的利用成为了关键所在。木质纤维素能够经过一系列的酶促反应降解生成单糖,进而可转化为可利用的能源物质,因此高效快速的降解纤维素成为技术突破的重要方向。本文以嗜热毛壳菌AA9家族(Auxiliary Activity family 9)的多糖单加氧酶(PMO)为研究对象,将酶经毕赤酵母表达,对酶的最适反应温度、pH等性质进行探索;通过对酶降解磷酸膨胀纤维素后的产物运用TLC薄层层析法、基质辅助激光解析电离飞行质谱(MALDI-TOF-MS)等方法进行分析以确定PMO氧化的区域选择性;并测定PMO对外切纤维素酶CBH1,内切纤维素酶EG1和β-葡聚糖酶CT2三种纤维素酶的协同作用。本文将嗜热毛壳菌经微晶纤维素诱导培养后提取RNA并反转录为cDNA,设计引物进行PCR扩增得到12个完整的PMO基因片段。选择pPICZαA酵母甲醇诱导型表达载体构建pPICZαA-PMO重组表达载体质粒,将载体质粒经电击转化构建PMO酵母工程菌,工程酵母菌经甲醇诱导发酵7 d表达蛋白,用硫酸铵沉淀法沉淀后经蛋白纯化仪纯化蛋白,SDS-PAGE检测蛋白纯度和分子量大小,选择表达量高的PMO0728,PMO0762,PMO5456,PMO6622,PMO14091五个PMO蛋白继续后续试验。通过设置一系列的温度梯度和pH梯度分别反应,确定多糖单加氧酶的最适反应温度为50°C,反应最适pH为5.0。在最适反应条件下用表达的5种酶分别降解磷酸膨胀纤维素,然后对反应产物进行TLC分析,PMO5456产物量更多,活性最好,所以以PMO5456为后续试验研究对象。对PMO5456降解PASC产物进行的TLC分析显示可溶性产物中含有G2-G6寡糖,证明该酶具有降解PASC的活性。为进一步确定PMO5456的氧化作用方式,对其反应产物进行MALDI-TOF-MS分析,根据峰值大小对应分子量进行分析,产物中有C1氧化寡糖(aldonic acid,m/z+16)峰值和C4氧化寡糖(C4-ketoaldose,m/z-2)或C6氧化寡糖(C6-hexodialdose,m/z-2)的峰值。可以确定的是有C1氧化,但是无法区分出C4和C6氧化的各自峰值。为区分出C4和C6氧化,本文采取溴水氧化的方式对底物进行进一步氧化,产物再次进行MALDI-TOF-MS分析。C1氧化寡糖不会被溴水氧化,分子量不变;C4氧化寡糖与溴水发生反应,氧化后生成产物的分子量相比较氧化前增加14;若存在C6氧化寡糖,也会被Br_2氧化,产物分子量相比较氧化前增加30;所以经Br_2氧化后,C4和C6产物分子量产生差异。MALDI-TOF-MS分析图谱中的峰值可推断PMO5456降解PASC过程中有C4氧化也有C6氧化。最终确定PMO酶的氧化方式是C1、C4和C6氧化。PMO作为辅助活性家族成员,对纤维素酶活性的提高作用是其重要特性。本文选取了来自嗜热毛壳菌的CBH1,EG1和CT2三种酶,分别加入经过PMO5456预处理的PASC中,用DNS法测定酶活,并与原酶活进行比较,结果可见随着PMO5456处理底物时间增加,三种纤维素酶活性随之增加。PMO5456处理后,内切纤维素酶EG1的活性提高了3.6倍;外切纤维素酶CBH1提高了2.2倍;β-葡萄糖苷酶CT2的酶活提高了0.6倍。最终确定PMO5456的氧化方式包括C1,C4和C6。对不同纤维素酶的活性辅助作用有所区别,PMO5456对内切纤维素酶EG1的活性提高最明显,外切纤维素酶次之,β-葡萄糖苷酶的酶活提高幅度较低。
【图文】：

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2 材料与方法2.1 材料2.1.1 试验菌株与试剂嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophile）由本实验室分离保存。毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115 购自 Invitrogen 公司。 T1 大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金公司。酵母甲醇诱导型表达载体 pPICZαA（图 2.1）购自 Invitrogen 公司。

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3.1 PMOs 保守 motif 结构及进化分析试验中对12个嗜热毛壳菌蛋白成员通过使用MEME motif搜索工具进行保守motif分析，共发现了 8 个不同的保守 motif（图 3.1）。结合进化分析，发现在整个嗜热毛壳菌的蛋白质成员中均具有相似 motif 组成，表明嗜热毛壳菌的所有 AA9 家族成员之间的功能具备相似性。进一步研究嗜热毛壳菌的保守结构域发现，在联配过后的 12 个AA9 序列中，每个 AA9 家族成员都具备 8 个结构域，但是他们在结构域的细节上却存在不同程度的差异，在整个物种中 AA9 家族表现出整体相似，细节差异的相对保守的motif 特性。根据进化关系（图 3.2），不难看出 AA9 家族的成员的保守性是极高的，同源性也相对较高，虽然在保守 motif 的顺序和结构上有细微的差异，但是仍有相对保守的结构以确定相似的功能特征。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

【参考文献】