海洋真菌中抗菌活性菌株的筛选及木贼镰刀菌Fusarium equiseti中eqxR基因过表达

发布时间：2020-04-03 10:21

【摘要】：海洋来源真菌生长于高吐压、低营养、低温、含盐海水环境中,形成了耐饥、耐盐、耐碱的独特生态特性和适应机制,产生不同于陆生微生物次生产物代谢产物。海洋来源真菌因可规模化培养引起药物学家的关注。海洋真菌的次生代谢产物类型主要包括生物碱、聚酮、肽类、甾体、萜类、等。多数化合物表现出抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等生物活性。目前全球抗菌药物不合理的使用加速了超级耐药细菌的产生,新一代抗生素的开发迫在眉睫。现有的抗生素绝大多数是从土壤源微生物中筛选获得,为了获得新型抗生素,海洋来源的抗生素引起了人们的极大兴趣海洋来源的天然产物较陆地来源的具有更新颖的结构、更强的活性,为发现更理想的抗菌先导化合物提供物质基础。本文建立一种快速筛选具有抗菌活性的真菌方法,设计并改良了一种双层琼脂板快速筛选方法利用改良双层琼脂板筛选法,从20株海洋来源的真菌中快速筛选获得一株具有显著抗菌活性的菌株WZXY-33-10,通过鉴定活性菌株为Fusarium equisetin并通过现代色谱学及波谱学方法从其发酵物中分离鉴定了 2个抗菌活性化合物equisetin(1)和epi-equisetin(2)能特异性杀灭多种多重耐药的革兰氏阳性菌,并对equisetin合成基因簇进行改造,得到equisetin高产菌株。随着DNA测序技术发展,许多新合成基因簇被发现,在这些微生物的次生代谢相关基因中,主要包括编码次级代谢途径的基因和调控基因,根据基因组序列分析,能够确定基因编码的酶所催化的化学反应,为我们有目的的进行基因改造。本文通过二代测序技术对这株Fusarium equiseti木贼镰刀菌进行全基因组测序,获得该株菌中equisetin生物合成基因簇的详细信息;分析各基因或结构域在equisetin合成过程中的功能,根据文献报道,对合成基区簇的调节因子eqxR进行过表达,通过PEG/CaC12介导原生质体遗传转化技术,对eqxR基因进行研究转化,从而获得突变菌株。
【图文】：

重组液放于－２０°Ｃ备用或者直接转化ＴｍｎｓＴｌ感受态逡逑图３－２闪电克隆连接原理模式图逡逑（１）使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底逡逑（２）单片段重组反应，５０°Ｃ邋５ｍｍ：降至４°Ｃ或立即置于冰上冷却。逡逑３．３．３转化感受态细胞并挑选单克隆菌落逡逑３．３．３．１制备感受态细胞逡逑（１）在ＬＢ固体平板挑取单克隆菌落（Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ），接种于ｌＯｍＬＬＢ液体培养基逡逑中，３７°Ｃ逡逑２２０ｒｐｍ，培养邋１２ｈ。逡逑（２）将菌液１：邋１００接种，如５００ｐＬ菌液加入到５０ｍＬ邋ＬＢ液体培养基中，，３７°Ｃ震逡逑荡培养３ｈ左右，ＯＤ值为０．４－０．５之间。逡逑（３）把菌液加到５０ｍＬ康宁离心管中，冰上静置ｌＯｍｉｎ。逡逑（４）逦４０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ，倒掉上清，将离心管倒置２ｍｉｎ，使培养基全部留走。逡逑

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本文编号：2613247