苜蓿链霉菌内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶表达及酶学性质的研究

发布时间：2020-04-09 21:32

【摘要】：内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作为糖苷酶家族的一员,它的主要作用方式是水解糖蛋白糖链上两个N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4糖苷键。内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶分别属于GH18家族和GH85家族。由于内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的去糖基化作用,因此在糖组学和糖生物学的研究中被广泛的使用。本文在苜蓿链霉菌ACCC40021全基因组测序的基础上,通过生物信息学分析,发现了一种新的内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因,CAZy表明该酶属于GH18家族一员,通过与文献中已报道β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶氨基酸序列进行同源性分析发现,与GH18家族的EndoFV和EndoT序列的相似性分别为38.19%和38.21%。根据NCBI数据库中已报道的其他内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和其他几丁质酶基因进行同源比较,构建系统进化树,根据结果可知,该酶与球孢子菌属几丁质酶III型亲缘关系最近。根据目的基因序列,构建了以pET30a(+)为载体的重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,成功诱导表达出目的蛋白,通过镍柱纯化后,获得纯的目的蛋白。以RNaseB作为反应底物,我们研究了该酶的酶学性质。该酶比活力为1.0×10~6U/mg,最适反应温度为35℃,在温度30℃-45℃范围内,有较好的热稳定性;最适反应pH为6,在pH值4-8之间,该酶保持有较高的酶活。选用酵母表达的糖基化糖化酶、果胶酶、酸性蛋白酶为底物,确定了能够完全的去糖基化,为糖蛋白糖基化位点研究提供了一种新的工具酶。应用该酶处理奶酪等奶制品加工的副产物乳清蛋白,从中制备寡糖链。在最适条件下,当加酶量为1 mg时,每分钟从每毫升乳清中可获得寡糖链0.95 mg。
【图文】：

图 2 酶法合成 CD52 蛋白糖链[41]Fig.2 The Enzymatic synthesis of CD52 protein sugar chain[41]（3）糖蛋白的改造牛胰核酸酶 B 是利用内切 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶进行 N-糖链修饰的一种的蛋白受体，在实验中常用商品化的 EndoH 处理牛胰腺核酸酶 B，牛胰腺核酸是由 124 个氨基酸组成，在它第 34 位的天冬酰胺氨基酸残基上连接有一个糖基点，通过这个位点连接一个高甘露糖型的糖链，EndoH 通过水解作用切除寡糖连一个去糖基化的牛胰腺核酸 B，然后以其为底物通过内切 β-N-乙酰氨基葡糖苷酶糖基作用，获得一个新的寡糖链，从而构成新的糖蛋白。在 2006 年 wang 等研员首次证明了使用嗯唑啉作为寡糖链的供体比使用天然糖链作为供体而后通过基作用得新合成的牛胰腺核酸酶 B 的产率更高，从而为糖蛋白的合成提供了一的思路。如图 3（a）所示。随后其用不同的嗯唑啉作为糖链的供体合成了带有类型的牛胰腺核酸酶 B，这些新合成的牛胰腺核酸酶 B 还可以作为底物进一步进学修饰[49]。在 2009 年 wang 通过对原有野生型的 EndoA 和 EndoM 的基因序列进变获取突变体 EndoA-N1717A 和 EndoM-N175A，单独使用突变体 EndoA-N1717行转糖基作用得到了较高产率的改造型牛胰腺核酸酶 B，如图 3（b）所示。并

程中起到保护葡萄糖残基的作用，，防止葡萄糖残基被内切酶水解，最后连接葡萄糖的末端甘露糖被甘露糖苷酶水解去除。这一方法为以后糖蛋白的定向改造提供了珍贵的借鉴意义，如图 3（d）所示。在 2016 年来自德国 Fairbanks 等研究人员首先使 N-末端甘露糖残基磷酸化，然后通过内切 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的作用合成了含有磷酸基团的糖蛋白，这里的磷酸基团起到一个标识的作用，通过特异性磷酸受体的识别，可用于溶酶体贮积症的治疗过程[51]。合成过程如图 3（e）所示。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55

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本文编号：2621288