DNA甲基转移酶N6AMT1基因敲降和过表达及其功能初探

发布时间：2020-04-13 16:40

【摘要】：6mA甲基化是DNA甲基化修饰的一种重要方式,受甲基转移酶N6AMT1基因的调控。为研究N6AMT1基因的功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建N6AMT1基因敲降的HEK293细胞系,同时在Hela细胞系中过表达N6AMT1基因,检测N6AMT1基因表达变化对细胞增殖和迁移能力的影响。结果表明:正常肾上皮组织细胞系HEK293中N6AMT1基因表达水平显著高于癌细胞;正常肝细胞系LO2中N6AMT1基因表达水平显著高于肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721;N6AMT1基因敲降显著增强HEK293细胞的增殖及迁移能力;而Hela细胞过表达N6AMT1基因后,细胞的增殖和迁移均显著受到抑制。这一研究提示N6AMT1基因介导的6mA甲基化可能对细胞增殖和迁移有重要影响。
【图文】：

细胞设３个重复。向配套的２４孔板中加入６００μＬ含２０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ完全培养基。培养２４ｈ后，用结晶紫染色２０ｍｉｎ后用棉签擦去小室内部细胞。随机选取９个视野观察细胞并拍照，使用ＩｍａｇｅＪ软件计算各细胞数量。１．５数据处理用ＳＰＳＳ２０．０统计软件进行差异分析，多组间比较采用单因素方差分析，通过Ｇｒａｐｈａｄ软件整理结果并作图。２结果与分析２．１Ｎ６ＡＭＴ１基因在不同细胞系中ＲＮＡ表达水平图１不同细胞系Ｎ６ＡＭＴ１基因相对表达量＊Ｆｉｇ．１ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＮ６ＡＭＴ１ｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌｌｉｎｅｓ＊Ａ．ＨＥＫ２９３；Ｂ．ＬＯ２；Ｃ．ＳＭＭＣ－７７２１；Ｄ．ＡＧＳ；Ｅ．ＢＣＧ８２３；Ｆ．ＨＣＴ１１６；Ｇ．Ｈｅｌａ；Ｈ．ＨｅｐＧ２；Ｉ．ＭＣＦ－７；Ｊ．ＭＤＡ－２３１；Ｋ．ＫＹＳＥ－１５０通过ＲＴ－ｑＰＣＲ检测２个正常细胞系（ＨＥＫ２９３、ＬＯ２）及９个癌细胞系（ＡＧＳ、ＢＧＣ８２３、ＨＣＴ１１６、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、ＫＹＳＥ－１５０、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－２３１和ＳＭＭＣ－７７２１）中Ｎ６ＡＭＴ１基因的表达水平，结果显示，Ｎ６ＡＭＴ１基因在ＨＥＫ２９３中表达水平最高，显著高于其他癌细胞系；人正常肝细胞系ＬＯ２中Ｎ６ＡＭＴ１基因的表达水平虽然低于ＨＥＫ２９３细胞，但显著高于肝癌细胞系ＨｅｐＧ２和ＳＭＭＣ－７７２１（图１）。这些结果表明肿瘤细胞中Ｎ６ＡＭＴ１基因的表达

图２不同细胞株Ｎ６ＡＭＴ１基因相对表达量＊Ｆｉｇ．２ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＮ６ＡＭＴ１ｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌｌｉｎｅｓ＊Ａ．ＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３细胞）；Ｂ～Ｇ．ＨＥＫ２９３－ＮＫ１～ＨＥＫ２９３－ＮＫ６（Ｎ６ＡＭＴ１基因敲降单克隆细胞）图３ＨＥＫ２９３和ＨＥＫ２９３－ＮＫ细胞生长曲线Ｆｉｇ．３ＣｅｌｌｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｓｏｆＨＥＫ２９３ａｎｄＨＥＫ２９３－ＮＫｃｅｌｌｓ＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１图４ＨＥＫ２９３和ＨＥＫ２９３－ＮＫ细胞的迁移Ｆｉｇ．４ＭｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＨＥＫ２９３ａｎｄＨＥＫ２９３－ＮＫｃｅｌｌｓ＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１因表达量显著升高。由图６可知，从细胞处理后第２天起，转染ｐｃ－ＤＮＡ３．１－Ｎ６ＡＭＴ１细胞（Ｈｅｌａ－ｐＮ）的增殖数量显著高于对照细胞（Ｈｅｌａ－ｐｃ）；处理后第３～５天两组细胞的增殖数量达到极显著差异。这说明升高Ｎ６ＡＭＴ１基因的表达水平，能显著抑制Ｈｅｌａ细胞的增殖。图５Ｈｅｌａ细胞转染Ｎ６ＡＭＴ１基因后的过表达＊Ｆｉｇ．５Ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＮ６ＡＭＴ１ｇｅｎｅｉｎＨｅｌａｃｅｌｌｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＮ６ＡＭＴ１＊Ａ．Ｈｅｌａ；Ｂ．Ｈｅｌａ－ｐｃ（转染ｐｃＤＮＡ３．１的Ｈｅｌａ细胞）；Ｃ．Ｈｅｌａ－ｐＮ（转染ｐｃ－ＤＮＡ３．１－Ｎ６ＡＭＴ１的Ｈｅｌａ细胞）图６过表达Ｎ６ＡＭＴ１基因对Ｈｅｌａ细胞生长的影

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