miRNAs及其靶基因在小桐子对低温响应与适应过程中的作用

发布时间：2020-04-20 06:52

【摘要】：小桐子是一种具有巨大开发潜力的能源植物树种,低温是影响小桐子存活和生长的主要限制因子。我们实验室前期研究表明低温锻炼显著提高小桐子的抗冷性。已知miRNAs在植物对逆境胁迫响应与适应中起重要作用,但miRNAs如何调控小桐子抗冷性尚未见到报道。弄清小桐子低温锻炼过程中miRNAs参与抗冷性提高的分子机制,获取与抗冷性密切相关的关键miRNAs及其靶基因,有助于我们更好理解小桐子抗冷性形成的分子机制。本研究首先进行了小桐子低温胁迫下microRNAs实时荧光定量PCR内参的筛选与比较,而后分析了低温锻炼诱导小桐子抗冷性形成过程中一些重要的miRNAs基因及其对应的靶基因表达的变化,为揭示miRNAs参与小桐子低温锻炼下抗冷性形成的分子机制提供了一定的理论和实验基础。研究结果如下:1.基于以前的小RNA-seq结果,以低温处理的小桐子为材料,挑选11个候选内参基因,用实时荧光定量PCR技术检测它们在不同样本中的表达量,采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行表达稳定性综合分析。结果表明,表达最稳定的基因是miR6448和U6,miR6448的Ct值为23左右,表达丰度适中;U6的Ct值为10左右,表达丰度高;因此,miR6448可作为小桐子低温胁迫下表达丰度适中的miRNAs qRT-PCR的内参基因;U6可作为小桐子低温胁迫下丰度较高的miRNAs qRT-PCR的内参基因。2.通过荧光定量PCR检测小桐子低温胁迫下的32个差异表达的候选miRNAs,发现除miR5284、miR5494、miR6189外,其它miRNAs的表达趋势与小RNA-seq的结果一致;检测结果表明:在低温胁迫处理期间经过锻炼小桐子幼苗中22个miRNAs的表达量高于未经过锻炼的;经过锻炼的小桐子幼苗中8个miRNAs的表达量低于未经过锻炼的;2个miRNAs的表达量在经过锻炼与未经锻炼的小桐子幼苗中无显著性差异。qRT-PCR的结果为低温锻炼诱导小桐子抗冷性形成过程中一些重要的miRNA的进一步研究提供一定的实验基础。3.通过对32个有差异表达的miRNAs进行的生物信息学分析,对其靶基因预测进行了GO富集、KEGG富集和功能归类。GO富集分析,参与脂质代谢过程的靶基因有10个,有84个基因参与蛋白质去磷酸化、信号转导和代谢过程等生物学过程;KEGG富集共获得212条pathway通路,参与植物激素信号传导的靶基因有12个,参与RNA转运的靶基因有12个,参与脂肪酸代谢的靶基因有9个,参与磷脂酶的有5个靶基因;对预测到的靶基因进行功能归类,大致分为:转录因子、蛋白激酶、磷酸酶、合酶、合成酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、还原酶、水解酶、磷脂酶、脱饱和酶。采用荧光定量PCR对小桐子低温胁迫下6个候选miRNA及其响应的与膜脂密切相关的靶基因,进行miRNA-mRNA表达模式分析,结果表明:miR5254对靶基因PLC起到负调控作用;miR5284对靶基因FAD6起到负调控作用;miR6189对靶基因FAR起到正调控作用;miR165、miR4239对靶基因PLA起到负调控作用;miR5827对靶基因FAD3起到负调控作用。4.从鉴定到的6个与低温胁迫下受miRNA调控的与膜脂密切相关的靶基因中,选取2个表达量高且变化倍数显著的基因(FAD3和FAD6),进行基因克隆、生物信息学分析及预测蛋白结构,为后续使用基因工程手段改良小桐子抗冷性提供了理论和实验基础。
【图文】：

小桐子,低温胁迫,幼苗,生长情况

第 1 章研究背景效地提高其抗冷能力，这在玉米、茄子、番茄、棉花和烟草上均表现为经过低温锻炼的的植株较未经过低温驯化的植株有更好的增长趋势[38-39]。我们实验室前人的研究证实小桐子幼苗经过 12 ℃低温锻炼，与未经过低温锻炼相比，在 1 ℃低温胁迫下，低温锻炼能显著提高低温胁迫下小桐子幼苗叶片和茎中抗氧化酶如氧化物酶、过氧化氢酶、愈创木酚过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶、脱氢抗坏血酸还原酶与单脱氢抗坏血酸还原酶等的活性，提高抗坏血酸和还原型谷胱甘肽的含量，且通过抗氧化酶和抗氧化剂的协同作用，降低小桐子幼苗中丙二醛含量的积累和电解质的渗漏，减缓由于低温胁迫而导致的活性氧损伤和膜损伤，抑制甜菜碱醛脱氢酶、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶、鸟氨酸转氨酶的活性，最终诱导幼苗叶片和茎中的渗透调节物质，如甜菜碱、脯氨酸、可溶性糖等的积累生物合成，在低温胁迫过程中降低小桐子幼苗叶片的渗透势和水势，提高小桐子幼苗对低温胁迫的抵抗能力[14-15]；研究表明，以冷敏植物临界生长温度12 ℃对小桐子幼苗进行低温锻炼能显著提高低温胁迫下小桐子的抗冷性，且研究表明 12 ℃低温锻炼 2d 的效果最佳，可明显提高小桐子抗冷性[14-15]（图 1.1）。AB

序列,双链,单链,核苷酸

第 1 章研究背景个突出核苷酸[54]。随后，DCL1 酶在核酸 CAP 结合复合体(CBC)的辅助下e-miRNA 切割成 miRNA::miRNA*二聚体双链结构。miRNA::miRNA*复合甲基化转移酶（HENI）识别，双链复合体中两条链 3'末端的 2'核糖羟基发基化，提高复合体的稳定性[55]。甲基化后 miRNA::miRNA*双链复合体在植内的 HST(HASTY)蛋白帮助下转运到细胞质中，miRNA::miRNA*双链复合过细胞质中的解旋酶作的用形成成熟的单链miRNA和miRNA*序列，miRN在 miRNA 加工成熟过程中与其互补的大约 22 个核苷酸的 RNA 序列；最熟的单链 miRNA 与 AGO(Argonaute)等蛋白形成 RNA 诱导的沉默复合NA-Induced Silencing Complex，RISC)，对靶基因行使调控的功能，而单链iRAN*则在体内被降解[56-57]。
【学位授予单位】：云南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q945.78

【参考文献】