粟酒裂殖酵母Ppr10-Mpa1复合体的制备
发布时间：2020-04-22 21:18
【摘要】：线粒体作为一种具有双层膜结构且能独立复制的细胞器,是细胞内合成ATP的主要场所。在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe,S.pombe)中,线粒体基因组(mtDNA)的表达对线粒体功能的发挥至关重要。mtDNA主要编码氧化磷酸化复合物的7个关键亚基,线粒体蛋白合成所需要的两个核糖体亚基和25种tRNA以及RNase P的RNA亚基(rnpB)。PPR蛋白含有2-30个PPR模体,该结构由简并的35个串联重复的氨基酸组成,可与RNA结合。在人和小鼠、植物和芽殖酵母等物种中,PPR蛋白参与了mtDNA编码的基因表达的转录和转录后调控。PPR蛋白与RNA特异结合,与RNA5′端成熟、内含子剪切、RNA编辑和稳定等密切相关。我们实验室报道Ppr10可以免疫共沉淀出Mpa1,以及Ppr10和Mpa1参与了线粒体蛋白质的翻译。但是不清楚Ppr10和Mpa1形成复合体的生理意义。本文针对上述问题开展了研究。首先利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)方法检测Ppr10和Mpa1在活细胞内的相互作用,Western blotting和荧光显微镜观察实验结果表明Ppr10与Mpa1在体内存在直接相互作用。另一方面,体外研究Ppr10和Mpa1相互作用的意义的关键是获得Ppr10-Mpa1复合体和Ppr10。本文利用粟酒裂殖酵母ESP~?表达系统表达了Ppr10-Mpa1复合体和Ppr10。为得到Ppr10-Mpa1复合体,利用ESP~?表达系统将ppr10和mpa1克隆到pESP2质粒上,实现蛋白Ppr10和Mpa1在粟酒裂殖酵母中共表达。利用FastPrep-24仪器和GST亲和层析柱纯化得到Ppr10-Mpa1复合体,复合体基本达到体外研究对于蛋白纯度的要求。作为对照实验,利用同样的方法在粟酒裂殖酵母中表达Ppr10并纯化GST-Ppr10。本文研究为后续体外研究Ppr10和Mpa1相互作用的生理意义,如利用荧光热稳定性方法检测Mpa1是否促进Ppr10的稳定性打下了基础。粟酒裂殖酵母Atp4被预测为线粒体ATP合酶F0的组成蛋白,但是具体功能并不清楚。本文通过表型研究发现atp4敲除后菌株出现生长缺陷,荧光显微镜观察发现atp4定位于线粒体内。Atp4的缺失导致线粒体基因组编码的蛋白Cob1、Cox1、Cox2和Atp6表达水平急剧下降。以上研究说明atp4对线粒体蛋白表达量的稳定很重要。
【图文】：
线粒体（mitochondria）是由内外两层平行的单位膜形成的封闭囊状结构。外膜起边界的作用，而内膜向内折叠成嵴。外膜和内膜将线粒体分隔形成膜间隙和线粒体基质。ATP、NAD 和辅酶 A 等自由通过外膜，使得膜间隙中的成分与胞质溶液相似。内膜富含心磷脂具有高度不透性，对于建立质子电化学梯度从而驱动 ATP 的合成具有重要意义。基质内含有大量与三羧酸循环（TCA）、脂肪酸氧化、氨基酸降解等有关的酶，同时与 DNA 复制和 RNA 合成相关。线粒体被组织成管状网络，其形态由分裂和融合控制，使其形态适应细胞的代谢需求[1]。线粒体间通过融合而相互连接，而通过分裂形成许多线粒体片段。在整个线粒体网络中通过分裂和融合充分地混合酶、代谢物和线粒体基因产物，相互连接的线粒体有益于活细胞的呼吸[2]。线粒体被认为是真核细胞的发源地，是三羧酸循环和氧化磷酸化的宿主。三羧酸循环是经过酶促反应再生成柠檬酸的过程，过程中产生的乙酰辅酶 A 与糖类、脂肪和蛋白质的代谢相联系。乙酰辅酶 A 进入 TCA 被氧化产生还原剂 NADH 和 FADH。NADH 和 FADH 将电子转移至线粒体呼吸链作为氧化磷酸化的电子供体。
点在双链上同时启动转录，，最终产生两条多顺反子，主要是分布在 mRNA 和 rRNA 之间的 tRNA 序列[18]达调控可以发生在多个方面，如线粒体基因组的拷、翻译及呼吸链亚基的稳定性。其中，线粒体翻译（Pentatricopeptide repeat，PPR）蛋白是由 2-30 个串并的 35 个氨基酸。PPR 模体主要与序列特异性的 殖酵母（Saccharomyces cerevisiae, S. cerevisiae）PP成复合体并与 COX1 的 mRNA 结合[17]。PPR 蛋白的列中的第 4 和 34 位氨基酸位置所决定的[22]。晶体结叠形成以一个环进行连接的一对反向平行的α-螺旋
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
本文编号：2636977
【图文】：
线粒体（mitochondria）是由内外两层平行的单位膜形成的封闭囊状结构。外膜起边界的作用，而内膜向内折叠成嵴。外膜和内膜将线粒体分隔形成膜间隙和线粒体基质。ATP、NAD 和辅酶 A 等自由通过外膜，使得膜间隙中的成分与胞质溶液相似。内膜富含心磷脂具有高度不透性，对于建立质子电化学梯度从而驱动 ATP 的合成具有重要意义。基质内含有大量与三羧酸循环（TCA）、脂肪酸氧化、氨基酸降解等有关的酶，同时与 DNA 复制和 RNA 合成相关。线粒体被组织成管状网络，其形态由分裂和融合控制，使其形态适应细胞的代谢需求[1]。线粒体间通过融合而相互连接，而通过分裂形成许多线粒体片段。在整个线粒体网络中通过分裂和融合充分地混合酶、代谢物和线粒体基因产物，相互连接的线粒体有益于活细胞的呼吸[2]。线粒体被认为是真核细胞的发源地，是三羧酸循环和氧化磷酸化的宿主。三羧酸循环是经过酶促反应再生成柠檬酸的过程，过程中产生的乙酰辅酶 A 与糖类、脂肪和蛋白质的代谢相联系。乙酰辅酶 A 进入 TCA 被氧化产生还原剂 NADH 和 FADH。NADH 和 FADH 将电子转移至线粒体呼吸链作为氧化磷酸化的电子供体。
点在双链上同时启动转录，，最终产生两条多顺反子，主要是分布在 mRNA 和 rRNA 之间的 tRNA 序列[18]达调控可以发生在多个方面，如线粒体基因组的拷、翻译及呼吸链亚基的稳定性。其中，线粒体翻译（Pentatricopeptide repeat，PPR）蛋白是由 2-30 个串并的 35 个氨基酸。PPR 模体主要与序列特异性的 殖酵母（Saccharomyces cerevisiae, S. cerevisiae）PP成复合体并与 COX1 的 mRNA 结合[17]。PPR 蛋白的列中的第 4 和 34 位氨基酸位置所决定的[22]。晶体结叠形成以一个环进行连接的一对反向平行的α-螺旋
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 李璞媛;白文涛;张芳琳;吴兴安;胡刚;刘艳丽;王海涛;张伟;徐志凯;;汉坦病毒囊膜糖蛋白G2在毕赤酵母GS115中的表达及鉴定[J];科学技术与工程;2007年08期
2 吴朝霞,郑文岭,马文丽;裂殖酵母作为外源基因表达系统[J];生命科学研究;2004年S1期
本文编号：2636977
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2636977.html
教材专著
