拟南芥蛋白质二硫键异构酶（AtPDI1）活性位点对抗逆功能的影响

发布时间：2020-04-23 01:42

【摘要】：蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)可以催化二硫键异构化、氧化及还原,也往往具有分子伴侣功能。来源于不同动、植物的PDI的活性中心都有2对保守半胱氨酸(Cys),突变后造成催化活性丧失,但不影响PDI的分子伴侣功能。前期研究表明体外重组表达的拟南芥AtPDI1具有二硫键异构酶活性,且能提高大肠杆菌细胞的抗逆能力。为了探究AtPDI1在植物体内是否有抗逆功能且是否与其二硫键异构酶活性有关,本研究将编码AtPDI1活性位点的Cys序列进行了突变,并回补拟南芥AtPDI1缺失突变体(pdi),研究不同株系对非生物胁迫的响应,主要研究结果如下:(1)突变AtPDI1活性中心半胱氨酸位点的编码序列,构建表达载体并转化拟南芥pdi,获得T3代纯合转基因植株。将编码AtPDI1活性位点的Cys(Cys128/Cys131、Cys467/Cys470)的密码子进行突变,得到两个突变体AtPDI1,即PDI1_(C128AC131A)和PDI1_(C467AC470A),用PDI1_(m1)和PDI1_(m2)表示。将之前构建的野生型AtPDI1及PDI1_(m1)和PDI1_(m2)转化拟南芥pdi,通过抗生素筛选、外源基因PCR鉴定,在T_3代获得纯合的转基因株系,分别表示为pdi-PDI1_(m1)、pdi-PDI1_(m2)和pdi-PDI1。(2)AtPDI1活性半胱氨酸位点突变影响了种子萌发阶段对胁迫的耐受性。对上述3个株系及野生型拟南芥(WT)、AtPDI1超表达株系(WT-PDI1)及pdi进行不同的处理,在非胁迫培养下,不同株系的萌发率及萌发速度基本一致,但胁迫培养下(培养基分别含有NaCl、甘露醇、H_2O_2和ABA),各株系的萌发差异明显,pdi-PDI1_(m1)和pdi-PDI1_(m2)的萌发率明显低于pdi-PDI1,pdi-PDI1的萌发率与WT相似,但低于超表达株系WT-PDI1;胁迫条件下根长的差异与萌发率有相似的趋势。(3)AtPDI1活性半胱氨酸位点突变也影响了幼苗对胁迫的耐受性。对苗期的不同AtPDI1株系进行胁迫处理,结果表明盐胁迫、渗透胁迫、低温和高温处理后,pdi-PDI1_(m1)、pdi-PDI1_(m2)和pdi突变体均表现出较低的胁迫耐受性,与WT、pdi-PDI1和WT-PDI1相比,生长缓慢,存活率较低;WT-PDI1抗性最强,pdi-PDI1与WT较为接近,说明野生型PDI1可以回补pdi功能的缺失,而保守半胱氨酸突变之后则不能回补pdi功能的缺失,表型与pdi相似,抗逆能力降低。(4)AtPDI1抗逆功能与ABA信号途径有关。利用qRT-PCR技术对ABA合成有关的基因(NCED3、ABA1、ABA2)的表达量进行检测,发现盐胁迫下pdi-PDI1_(m1)、pdi-PDI1_(m2)与pdi突变体的上调倍数差异不大,但明显低于pdi-PDI1、WT和WT-PDI1;盐胁迫也影响了ABA信号转导途径相关基因(RD29A、KIN1、AnnAt)的表达,不同株系变化趋势的差异与ABA合成有关的基因类似。说明AtPDI1提高植物的抗逆能力与ABA合成和其信号途径有关,且保守Cys对AtPDI1功能的发挥起重要作用。(5)AtPDI1活性位点突变影响了植物体内ROS清除能力。对盐和渗透胁迫处理后的ROS积累量进行了NBT染色检测,pdi-PDI1_(m1)、pdi-PDI1_(m2)与pdi的染色程度最深,说明其ROS积累多;pdi-PDI1与WT的染色次之,但重于WT-PDI1的染色。各株系活性氧清除相关基因SOD、POD、CAT和APX的表达与ROS的积累相反,WT-PDI1表达量上调倍数最多,而pdi-PDI1_(m1)、pdi-PDI1_(m2)与pdi的上调倍数最低。以上研究结果表明,AtPDI1催化二硫键的功能对其在植物中发挥抗非生物胁迫的功能直接相关,且AtPDI1的抗逆功能与ABA信号转导途径及活性氧清除有关。
【图文】：

示意图,酵母,三维结构,示意图

山东农业大学硕士学位论文图 1-1 蛋白质二硫键异构酶结构图Fig. 1-1 Domain organization of PDI酵母 PDI 的分子结构研究较为深入，其全长 PDI 的晶体结构已被解）。酵母 PDI 由 a、b、b’、a’结构域以及一个链接子（x）和一个羧以 a、b、b’、x、a’、c 的顺序排列构成（如图 1-2 所示）。酵母 P，U型的两个活动侧臂分别由 a结构域和 a’结构域组成，而 b 结构对固定的 U 型结构的底部，U 型结构的疏水内表面为 PDI 结合底 PDI 的空间示意图如图 1-2 所示。

二硫键,巯基,硫氧还蛋白

之间的两个氨基酸在氧化还原电位中也起着至关重要的作用（Ellgaard and Ruddock,2005；Martin, 1995）。硫氧还蛋白超家族成员还包括 DsbA（一种细菌氧化酶）、DsbC（一种大肠杆菌的周质蛋白）、硫氧还蛋白、谷氧还蛋白和维生素 K 环氧化物还原酶（VKOR）等。具有硫氧还蛋白结构域的氧化还原蛋白可以作为是二硫键的还原剂，如硫氧还蛋白本身；也可以是二硫醇的氧化剂，如 DsbA 和 PDI；或者是转移非天然二硫键的异构酶，如 PDI 和 DsbC（Messens and Collet, 2006；Wilkinson and Gilbert, 2004）。含有硫氧还蛋白结构域的蛋白质具有氧化还原活性，其催化机制与巯基/二硫键的转换有关（如图 1-3）。硫氧还蛋白超家族活性位点中的半胱氨酸可以作为二硫键（氧化）状态的电子受体或巯基（还原）状态的电子供体。在电子转移到底物分子或从底物分子转移电子期间，，CXXC 催化基序可逆地从一种氧化还原状态转换到另一种氧化还原状态（Gruber et al., 2006）。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2

【参考文献】