【摘要】：脂肪酶作为重要的工业酶制剂之一,以其独特的催化特性广泛应用在工业生产中。然而,工业生产往往伴随高温条件,天然脂肪酶的热稳定性难以满足应用要求,导致生产损失率高、生产成本增加。针对这种现状,本研究利用基因融合手段、定点突变技术并结合结构晶体分析对脂肪酶的热稳定性进行改造,主要包括:1.利用基因融合手段对两种脂肪酶进行热稳定性改造,包括来源于华根霉的热稳定性较差的脂肪酶r27RCL和难以满足工业生产要求的来源于嗜热丝孢菌的脂肪酶TLL。本研究利用刚性接头(Linker1,L1)和柔性接头(Linker2,L2)将具有疏水性的自组装双亲短肽SAP(AEAEAKAKAEAEAKAK)分别与两种脂肪酶N端融合以提高蛋白质表面的疏水性,从而增强蛋白质的稳定程度。通过实验获得了四株热稳定性提高的融合脂肪酶(SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL)。对脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL在60℃下进行热稳定性实验,结果表明:融合蛋白SAP-L1-r27RCL和SAP-L2-r27RCL的半衰期较野生型分别提高1.75倍和1.20倍。对脂肪酶TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL在80℃下进行热稳定性实验,发现融合蛋白SAP-L1-TLL和SAP-L2-TLL半衰期较野生型分别提高1.50倍和1.17倍。此外,催化反应动力学结果表明四种融合脂肪酶的底物亲和性和催化效率较野生型均有明显提高。综上,对脂肪酶N端进行SAP短肽融合改造可以提高其热稳定性,且刚性接头较柔性接头效果更佳。2.提取脂肪酶r27RCL晶体结构中所有氨基酸的温度因子(B-factor),并进行归一化处理,发现氨基酸序列(63-TKWDCK-68)的B-factor较大,说明该区域极不稳定。下载自NCBI数据库中所有耐热性/嗜热真菌脂肪酶(共92条),并进行多序列比对,统计发现耐热/嗜热真菌脂肪酶在此区域的保守序列为63-TNITCT-68。比较两段序列,设计突变位点K64N、W65I、D66T、K68T,并进行定点突变和异源表达,最终获得两株热稳定性提高得突变脂肪酶(r27RCL-K64N、r27RCL-K68T)。在50℃条件下对野生型和突变型脂肪酶耐受120 min,结果表明:r27RCL-K64N和r27RCL-K68T相对剩余酶活较野生型分别提高37.88%和48.20%;在60℃条件下对野生型和突变型脂肪酶耐受90 min,r27RCL-K64N与r27RCL-K68T的半衰期较野生型分别提高了2.4倍和3.0倍;而突变体r27RCL-W65I和r27RCL-D66T的热稳定性较野生型下降。此外,突变脂肪酶的底物亲和性和催化效率较野生型均有明显提高。通过对突变体进行结构模建探索突变体耐热性改变的原因:突变位点K64N和K68T仍保持了野生型脂肪酶该位点与周围氨基酸的氢键相互作用,而突变氨基酸(N64和T68)具有相比于野生型氨基酸更短的侧链,使得该位点的浮动减小、稳定性增强;当将W65突变为I65后,该位点与周围氨基酸的氢键相互作用消失,致使其稳定性下降。3.通过对脂肪酶r27RCL进行三维结构研究发现该脂肪酶含有一个未成对的半胱氨酸C204。利用在线软件Disulfide by Design 2.0预测结构中能够形成二硫键的成对氨基酸,结果表明若将距C204 3.8?的T201突变为C201,C201和C204能够形成二硫键。实验以r27RCL基因为野生型,经定点突变、异源表达获得一株热稳定性明显提高的突变脂肪酶r27RCL-T201C。分别在50℃和60℃条件下对野生型和突变型脂肪酶进行耐受,r27RCL-T201C的半衰期较野生型分别提高了1.25和1.50倍。此外,r27RCL-T201C的底物亲和性和催化效率较野生型有明显提升。然而,突变体r27RCL-T201C的最适温度相比于野生型下降5℃。结构模建发现突变位点T201C靠近影响脂肪酶最适温度的酪氨酸残基(Y200),新增二硫键局部结构域的稳定性的影响可能导致Y200的不稳定性增强,导致突变脂肪酶r27RCL-T201C最适温度降低。
【图文】：
增加 PCR 反应中的突变频率，定频率随机地掺入到扩增的基因中，进些突变群体通过合适的载体克隆出来[41,模版，利用易错 PCR 进行随机突变后出一株酶突变株在 50℃下酶活是 37℃下：是一种基于 PCR 技术，利用多次、反核苷酸的方法[44]。DNA 重组技术主要基因家族打碎成一定长度的片段，后以在 PCR 延伸程序中利用部分同源性进行延伸，同时来源不同的基因间也会发生，直至扩出全长基因[45,46](如图 1.1)。antarctica lipase B 进行家族改组，获得了 20 倍，同时也获得了一种在 45℃的肪酶 B[47]。
一种毕赤酵母常用的表达载体Figure1.2Acommonexpressionvectorofpichiapastoris
【学位授予单位】：云南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55
【参考文献】
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2637959
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