拟南芥褪黑素响应UV-B胁迫的功能和其合成酶表达研究

发布时间：2020-04-24 02:57

【摘要】：褪黑素是动植物体内重要的吲哚类信号物质,在植物中起着重要的作用。植物可以感知UV-B辐射,进而通过信号转导调节生长发育或者抵御伤害。为了研究植物褪黑素在UV-B胁迫中的作用及三个褪黑素合成酶在整个生命周期的功能,本研究首先成功获得拟南芥褪黑素合成酶ASMT(N-acetylserotonin methyltransferase)和COMT(caffeic acid O-methyltransferase)的过表达植株以及SNAT(Serotonin N-acetyltransferase)过表达植株SNAT1-OE、SNAT3-OE(不同剪切本),同时筛选出SNAT的T-DNA插入突变体株系SALK_032239,以及三种褪黑素合成酶Pro_(SNAT)::GUS、Pro_(COMT)::GUS和Pro_(ASMT)::GUS转基因株系。通过组织化学染色和qRT-PCR技术对拟南芥褪黑素三个合成酶的时空表达特性进行分析;并且分别对SNAT1-OE、SNAT3-OE、Col-0和snat拟南芥采用UV-B辐射(313nm)处理,运用qRT-PCR技术分析褪黑素合成酶基因ASMT、COMT和SNAT相对表达量及UV-B信号通路基因和UV-B效应基因表达情况;利用ELISA实验,检测了转基因植株在不同时间段处理下褪黑素的积累量;通过DAB(Diaminobenzidine)染色、NBT(Nitrotetrazolium blue)染色、H_2O_2含量检测、丙二醛(MDA)含量检测和电解质泄漏等生理实验,阐明了褪黑素对长时间UV-B胁迫具有抵抗作用。主要研究成果如下:(1)通过组织化学染色和qRT-PCR技术对三个拟南芥褪黑素合成酶基因表达模式分析发现,SNAT在拟南芥植株花器官和角果中表达量高;COMT不仅在拟南芥营养生长阶段表达量高,而且在生殖生长阶段表达量也很高;ASMT主要在根和花器官中表达。(2)为了研究褪黑素在UV-B胁迫中的作用,我们分别构建了pRI101-SNAT、pRI101-COMT和pRI101-ASMT植物双元表达载体,通过冻融法将重组载体成功转化至土壤农杆菌株GV3101,使用浸花法分别转化拟南芥Col-0,通过抗性筛选和基因组DNA初步鉴定确定35S::ASMT转基因植株16株、35S::COMT转基因植株8株、35S::SNAT1转基因植株20株、35S::SNAT3转基因植株9株,说明外源DNA均成功插入到拟南芥Col-0基因组中。通过qRT-PCR实验发现大部分过表达植株的mRNA相对表达量远大于Col-0;最后通过ELISA对过表达植株进行褪黑素含量检测,结果显示大多数转基因过表达株系的褪黑素含量上升1.5-2倍。通过PCR实验筛选得到SNAT纯合突变体SALK_032239。选取AtSNAT的突变体和过表达转基因植株进行表型观察,Col-0的根长为4.6±0.16cm,snat的根长为3.47±0.25cm,SNAT1-OE与SNAT3-OE根长分别为5.2±0.17cm、5.3±0.13cm,这一结果表明,SNAT基因缺失导致根的生长受阻;SNAT基因过表达促进根的生长。在313nm UV-B辐射下,不同时间段分别处理SNAT的不同剪切本过表达株系SNAT1-OE、SNAT3-OE、Col-0和snat拟南芥。qRT-PCR结果表明,UV-B处理2h时,褪黑素合成酶基因SNAT、COMT、ASMT的mRNA相对表达量峰值远大于Col-0或者snat;ELISA实验结果发现,UV-B处理4h时,SNAT1、SNAT3过表达植株褪黑素含量分别是Col-0增幅的1倍和2倍,是snat突变体的3倍和3.2倍。同时,在褪黑素合成酶SNAT、COMT和ASMT基因和褪黑素含量方面,SNAT3-OE植株的表达都比SNAT1-OE显著。(3)我们通过qRT-PCR技术检测了UV-B信号通路相关基因表达情况,结果表明,与Col-0植株相比,SNAT过表达植株中HY5(ELONGATED HYPOCOTYL 5)的相对表达量明显上升,同时COP1(CONSTITUTIVELYPHOTOMORPHOGENIC 1)、HYH(HY5HOMOLOG)、RUP1(REPRESSOR OF UV-B PHOTOMORPHOGENESIS 1)和RUP2(REPRESSOR OF UV-B PHOTOMORPHOGENESIS 2)的相对表达量也明显上升;snat突变体植株中HY5的相对表达量最小。实验结果证明,SNAT基因可以影响UV-B信号通路,同时其下游效应基因APX(Ascorbate Peroxidase)、SAPX(Chloroplast APX)、CAT1(Catalase1)、CSD1(Cytosolic Superoxide Dismutase 1)的相对表达量提高,引发植物机体内ROS含量降低。DAB染色、NBT染色、H_2O_2含量测定结果表明在4h、6h时,过表达转基因植株体内ROS含量少于Col-0和snat;MDA含量测定结果表明在4h、6h时,过表达转基因植株体内MDA含量低于Col-0和snat;电解质泄露实验结果表明在2h、4h、6h,过表转基因植株的电导率值小于Col-0和snat。这些结果说明拟南芥体内褪黑素含量的增加提高了植株对于UV-B辐射的感知,并提高了抗性,同时SNAT的剪切本SNAT3-OE株系对于UV-B的抗性强于SNAT1-OE。
【图文】：

路径图,色氨酸,哺乳动物,植物

第一章绪论叶绿体，可能会以不同的模式影响褪黑素在植物中胺在衰老的水稻叶片中高含量积累，而色胺和 N-中通过 T5H 可快速将色胺转化为 5-羟色胺，但 5-羟转化缓慢，，所以 SNAT 也是合成途径的限速酶。存成途径在维持褪黑素稳态中起着重要作用，同时植诱导褪黑素的合成[37,38]。

褪黑素,植物,5-羟色胺,甲基转移酶

图 1-2 植物褪黑素合成的多种途径[36]Fig.1-2 The multiple pathways of melatonin biosynthesis in plants[36].TDC，色氨酸脱羧酶；TPH，色氨酸羟化酶；T5H，色胺 5-羟化酶；SNAT，5-羟色胺SMT，乙酰 5-羟色胺甲基转移酶；COMT，咖啡酸甲基转移酶；ER，内质网。 1-3 拟南芥 SNAT 、COMT and ASMT 参与的褪黑素生物合成的概述[39]3 Overview of possible melatonin biosynthesis by SNAT 、COMT and ASMT in ArabidASMT/ASMT/ASMT
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2

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