微管蛋白β-2b链突变体真核表达载体的构建及对微管聚合的研究

发布时间：2020-04-30 05:16

【摘要】：微管由交替出现的α微管蛋白和β微管蛋白组成,微管蛋白β-2b链(tubulin beta-2B chain,TUBB2B)是β微管蛋白的亚型基因,它是微管的主要成分。微管蛋白基因TUBB2B的突变会改变微管的正常功能和结构。研究发现TUBB2B蛋白第247位点天冬酰胺突变为丝氨酸会导致小鼠大脑皮质的损坏和异常发育,本文就TUBB2B突变基因TUBB2B(N247S)对微管聚合的影响展开分析。本实验以C57bl/6j小鼠总RNA为模板,反转录得到cDNA,通过与T载体连接构建了TUBB2B基因克隆载体,并通过点突变技术构建了TUBB2B(N247S)基因克隆载体。使用DNA限制性酶切技术构建了TUBB2B(N247S)-p3-flag-cmv-10真核表达载体,并在转染试剂的介导下,将真核重组表达载体及空载体转染至小鼠成纤维细胞L929中,设置空白组和对照组,对不同组的细胞进行微管蛋白的提取,通过Western-blot技术对α微管蛋白表达量进行分析,收集表达的突变蛋白并通过磁分离技术进行纯化,为了研究突变蛋白对微管骨架的影响,对纯化后的突变蛋白进行体外聚合实验分析,所得结果如下:1.构建的TUBB2B以及TUBB2B(N247S)克隆载体经菌液PCR及DNA鉴定证明克隆载体构建正确。2.目的片段与真核表达载体连接成功,并通过菌液PCR,双酶切及DNA测序结果鉴定,成功构建TUBB2B(N247S)-p3-flag-cmv-10真核重组表达载体。3.成功转染L929细胞,以及成功表达突变蛋白,经过优化诱导表达条件,确定了以6孔板为准,最佳目的基因与转染试剂的比例为8:1,且实现了TUBB2B基因在L929中的高效表达。4.转染组与空白组及对照组进行比较,游离态的α微管蛋白显著高于对照组和空白组(P值分别为0.0001和0.0004),聚合态的α微管蛋白显著低于对照组和空白组(P值分别为0.0004和0.0036)。5.磁分离技术纯化可以得到较高浓度的目的蛋白。6.TUBB2B(N247S)突变蛋白对微管蛋白体外聚合具有一定的抑制作用。
【图文】：

3 结果与分析 克隆载体的构建 总 RNA 的提取j 小鼠进行全脑的取样，通过 mRNA 试剂盒提取 检测，其浓度为 256 ng/μL，260/280 为 1.84，将提胶电泳上进行电泳，结果如图 3.1 所示，可见在 2于反转录，见图 1.1。将得到的 rna 进行反转录得进行后续 PCR 实验。

图 1.2 TUBB2B 基因 PCR 扩增结果Fig.1.2 PCR amplification of TUBB2B geM: DL1500; 1-6: TUBB2B PCR 扩增结果图L1500; 1-6: PCR amplification of TUBB2隆载体的鉴定的 DNA 片段与 T 载体连接，，转化至B 固体培养基进行抗性筛选，白色的为多，说明连接效果较好。同时挑取白色扩培后的菌液使用特异性引物和载体R，结果如图 1.3，1.4，1.5 所示，分别，测序结果如图所示，得到与目的片段体构建成功。将阳性菌液保菌，以备后
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

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本文编号：2645434