塑化剂邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）水解酶的基因挖掘与催化性能研究

发布时间：2020-05-02 15:56

【摘要】：邻苯二甲酸酯(Phthalate esters,PAEs),俗称增塑剂,被广泛地应用于各类塑料制品的生产和加工。其中的邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)在全球范围内的使用量最大,近年的年消费量超过300万吨。研究表明,PAEs作为环境激素(Environmental Endocrine Disruptors,EEDs)会对生态环境和人类健康造成极大的危害,在低浓度下即可干扰人和动物的内分泌系统。在过去的几十年中,生物降解法作为PAEs主要的降解方式被国内外学者广泛地报道。目前,已知的PAEs水解酶主要作用于短烷基侧链PAEs和邻苯二甲酸单酯中酯键的水解,然而,最受关注的DEHP降解酶的报道却很少。至今为止,DEHP降解酶的基因和蛋白质序列,以及酶学特征仍是未知的,这阻碍了我们对大侧链PAEs酶学降解的认识和进一步的应用。本研究首先采用菌种驯化的方法从200份被塑料垃圾污染的土壤样品中分离鉴定出6株对DEHP具有催化活性的菌株,包括1株Rhodococcus sp.,1株Micrococcus sp.和4株Gorrdonia sp.,其中,Gordonia polyisoprenivorans 5F催化活性最高。通过对降解中间产物的分析,我们推测出DEHP在菌株5F中的降解路径。接着通过基因挖掘技术从5F菌株中克隆得到17个潜在的酯酶基因,将它们连接到pET-28a质粒载体上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达。最终成功筛选到可降解DEHP的目标酶(GoEst15),该酶可将DEHP降解成邻苯二甲酸单(2-乙基已)酯(MEHP)。通过对GoEst15的纯化,确定了该酶蛋白的分子量为58 kDa,利用酯酶的模式底物对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)测出其反应的最适pH和温度分别为7.0和30。对于DEHP,GoEst15的Km和kcat/Km值分别为0.31 mM和0.16 s-1mM-1。降解反应研究显示,在1 mL反应体系中,0.15 mg GoEstl5可在24小时内完全降解5mM的DEHP;而完全降解5 mM的DBP,仅需要1小时。底物谱测试实验表明,该酶能够催化十一种PAEs的降解反应,是一种罕见的广谱酯酶。此外,我们还挖掘到了Gordoniapoly soprenivorans 5F中的MEHP水解酶(GoEstM1),并构建了GoEst15和GoEstM1的共表达体系,利用该体系可实现从PAEs到邻苯二甲酸(PA)的一步转化。综上所述,GoEst15是新发现的一种能够降解DEHP的酯酶。由于其良好的降解效果和广泛的底物谱,该酶将是一种很有前景的生物催化剂,可作为蛋白质工程的起始酶,为未来污染物生物降解,土体生物修复和水治理开发绿色、温和、高效的技术。
【图文】：

２．３．３菌株复筛结果逡逑将得到的六种单菌株与１邋ｇ／Ｌ邋ＤＥＨＰ反应４天后进行ＴＬＣ分析，发现它们对ＤＥＨＰ逡逑均具有催化活性。薄层色谱分析结果如图２．１所示，对照样品Ｃ中的底物斑点最深，其逡逑余６个样品的底物斑点均出现了不同程度的减少。其屮菌株５Ｆ与ＤＥＨＰ反应液的底物逡逑斑点最浅，菌株ＳＪ２２和阐株ＳＪ６丨对应的底物斑点也较浅，而其余三种菌株的反应液中逡逑有较多的底物残留。菌株６Ｆ－１与ＤＥＨＰ的反应液中除了残留的底物斑点外，还出现，逡逑米被降解的产物斑点，将反应液进行ＧＣ－ＭＳ分析，，鉴定出该产物为ＭＥＨＰ（ＧＣ－ＭＳ分逡逑析方法见第三章），由此可推测，菌株６Ｆ－１缺乏ＭＥＨＰ的代谢途径或者存在的ＭＥＨＰ降逡逑解酶活力很低，导致ＤＥＨＰ无法完全降解。逡逑ｒ逦＾邋１逡逑＾－ＤＥＩＩＰ逡逑＾逦＞邋Ｌ邋Ｊ邋…逦＊逦一逡逑Ｃ邋ＳＪ６１邋ＳＪ２２邋５Ｆ邋６Ｆ－１邋Ｃ邋６ＦＴ邋ＦＸ１４逡逑图２．１单菌株对ＤＥＨＰ活性大小的ＴＬＣ分析逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ａｓｓａｙ邋ｏｆ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｂｙ邋ＴＬＣ逡逑２．３．４菌种鉴定结果逡逑将得到的６个ＤＥＨＰ降解菌株进行１６Ｓ邋ｒＲＮＡ鉴定，ＰＣＲ产物的核酸电泳图如图逡逑２．２所示，该图显示每个菌株的１６ＳｒＲＮＡ目的条带清晰争一，大小均在］５００邋ｂｐ左右。逡逑

３．３．１反应最适ｐＨ逡逑５Ｆ在邋ｐＨ邋５．０邋到邋ｐＨ邋９．０邋的条件下者能句多降解利用邋ＤＥＨＰ。逡逑初始0Ｄ６0Ｇ为０．１的５Ｆ菌液与１邋ｇ／ＬＤＥＨＰ在３０°Ｃ反应３天后的ＤＥＨＰ降解率如图３．１逡逑所示，在ｐＨ邋７．０时有接近９０％的底物被降解掉，ｐＨ邋７．０、ｐＨ邋８．０和ｐＨ邋９．０的条件下对逡逑ＤＥＨＰ的降解效果明显优于ｐＨ邋５．０和ｐＨ邋６．０的情况。可见中性及偏碱性的条件比酸性逡逑条件更利于菌株５Ｆ降解ＤＥＨＰ，从图中可知反应的最适ｐＨ为７．０，因此选择此条件进逡逑行后续的研[偂ｅ义希掊澹保玻板澹蝈义希

本文编号：2647235