Tfcp211诱导Esrrb表达促进小鼠胚胎干细胞自我更新的机制研究

发布时间：2020-05-09 16:11

【摘要】：着床前胚胎的发育和由早期囊胚衍生而来的干细胞系受到高度调节。从小鼠的囊胚期,可以分离出三种不同的干细胞类型并且可以在体外进行培养。这些干细胞类型包括来自滋养外胚层的滋养层干细胞(Trophoblast Stem,TS);来自原始内胚层的干细胞样胚外内胚层(Stem-cell-like Extraembryonic Endoderm,XEN)细胞以及分离自着床前的囊胚内细胞团细胞(Inner cell mass,ICM),即胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs);其中研究最热的是小鼠胚胎干细胞(mESCs)。在体外合适的培养条件下,ESCs只保持无限增值的能力而不发生分化,简称“自我更新”,同时保留分化成三个胚层的能力,简称“多能性”。到目前为止,虽然已经建立了多个物种的类似胚胎干细胞的细胞系,但是只有来源于小鼠和大鼠的胚胎干细胞可以产生嵌合体后代,称为naive多能性状态。有趣的是,在自我更新的特性和形态方面,人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)更类似于小鼠外胚层干细胞(mouse Epiblast Stem Cells,mEpiSCs)而不是mESCs,我们称这个状态为primed多能性状态。值得注意的是,通过过表达单个基因,例如Stat3,Tfcp211和Klf4,可以将primed多能性状态的ESCs重编程回到naive多能性状态。mESCs和mEpiSCs需要不同的培养条件来维持多能性。mEpiSCs主要依赖成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)和重组人激活素-A(Recombinant Human Activin-A,ActivinA)来维持自我更新。而mESCs可以通过两种不同的培养体系来维持自我更新:添加白血病抑制因子(Leukaemia inhibitory factor,LIF)的血清培养基,以及添加两个小分子抑制剂(2i)的无血清培养基N2B27,2i指CHIR99021和PD0325901,它们维持自我更新分别是通过抑制糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3β)和分裂原活化蛋白激酶的激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase,MEK),而LIF维持自我更新是通过激活信号转导与激活因子3(STAT3),从而进一步激活STAT3下游的一些多能性基因,比如:Tfcp211,Kl4,和Piml等,其中的每一个过表达都可以替代STAT3来维持自我更新。但是,只有下调Tfcp211的表达才能够削弱LIF/STAT3信号通路介导的自我更新和mEpiSCs的重编程。先前的文献报道,作为LIF/STAT3下游的靶基因,转录因子Tfcp211(Transcription factor CP2-like protein 1),在建立和维持mESC naive多能性状态中扮演着很重要的角色。Tfcp211的过表达不仅可以取代LIF和2i中的任何一个因子的作用来促进mESCs的自我更新能力,还可以提高mEpiSCs重编程为naive多能性状态的效率。但是,Tfcp211是通过下游的哪些靶基因的作用来维持自我更新还不清楚。为了研究这个问题,我们首先鉴定出Tfcp211下游的靶基因,再对其进行一系列的验证。根据2014年Dunn S J在Science杂志上发表的一篇文献[Doi:10.1126/science.1248882],Estrogen related receptor beta(Esrrb)和Salian-like gene(Sa114)可能是Tfcp211下游的靶基因。为了验证这一预测,我们首先在小鼠胚胎干细胞中过表达Tfcp211,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析Esrrb和Sa114的表达情况。结果显示,过表达Tfcp211只有Esrrb的表达量较高,我们初步确定了Esrrb是Tfcp211的下游靶基因。接着,为了进一步确定Esrrb是Tfcp211的下游靶基因,我们实施了以下4个实验。第一,我们构建了一个Tfcp211可诱导表达的细胞株,并分时间段加入四环素(DOX)来诱导Tfcp211的表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析Esrrb的表达情况。结果显示,诱导时间越长,Esrrb的表达量越高。第二,在mESCs中下调Tfcp211的表达,qRT-PCR结果显示,Esrrb的表达量也随之降低。第三,我们从JASPAR数据库中分析了Tfcp211在Esrrb启动子上的结合位点,并进行了染色质免疫共沉淀实验(ChIP)。结果显示,Tfcp211在Esrrb启动子上具有很高的结合能力。最后,为了进一步验证Tfcp211与Esrrb的相互作用,我们在Esrrb启动子上突变了Tfcp211结合位点,并做了荧光素酶报告实验。结果显示,野生型的荧光强度是突变型的荧光强度的2.7倍。以上数据说明,Esrrb是Tfcp211下游的直接靶基因。以上数据说明,Esrrb是Tfcp211的直接靶基因,那么Esrrb是否可以调控Tfcp211的功能呢?因此,我们设计了以下两个实验。第一,在过表达Tfcp211的mESCs中下调Esrrb,经过形态学观察、碱性磷酸酶染色以及免疫荧光实验,表明干扰Esrrb的表达会导致过表达Tfcp211的小鼠胚胎干细胞分化;第二,在mEpiSCs中过表达Tfcp211,同时下调Esrrb的表达,结果显示Esrrb能够削弱Tfcp211重编程mEpiSCs回到mESCs的能力。综上所述,我们的研究结果证明Tfcp211主要通过诱导Esrrb的表达来维持小鼠胚胎干细胞的自我更新。该研究结果不仅丰富和完善了干细胞多能性调控网络,而且为干细胞以后的临床应用打下了理论基础。
【图文】：

过表达,靶基因,生物信息学分析,蛋白质印迹

１．１初筛Ｔｆｃｐ２１１下游靶基因逡逑根据２０１４年Ｄｕｎｎ邋Ｓ邋Ｊ在Ｓｃｉｅｎｃｅ杂志上发表的一篇文献［Ｄｏｉ．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ｌ２４８８８２］，作者根据生物信息学分析显示，和＆／／４可能ｃｐ２１１下游的靶基因，所以我们先进行初筛。逡逑第一，我们构建了一个带有ＦＬＡＧ标签的过表达Ｔｆｃｐ２１１邋（ＰＢ－ｍＴｆｃｐ２１１）Ｃ细胞，并通过蛋白质印迹实验证明ＴＦＣＰ２Ｌ１蛋白在细胞中过表达成功（ＦｉＡ）。逡逑第二，对ＰＢ－ｍＴｆｃｐ２１１的４６Ｃ细胞进行提取总ＲＮＡ，再通过ｑＲＴ－ＰＣＲ检和基因表达情况。结果显示，过表达Ｔｆｃｐ２１１只有表达量较Ｆｉｇ．邋１Ｂ）。逡逑根据这个结果，我们可以初步确定是Ｔｆｃｐ２１１下游的靶基因。逡逑

慢病毒,靶基因,转录水平,细胞株

逡逑３．１．２邋Ｔｆｃｐ２１１调控下游Ｅｓｒｒｂ的表达逡逑经过初筛之后，我们排除了邋ＳａｌＩ４基因。接下来为了进一步验证Ｅｓｒｒｂ是是Ｔｆｃｐ２１１可能的靶基因，我们从以下两个方面进行探宄。逡逑第一，我们构建了邋ＴｆＣｐ２ｌｌ可诱导表达的细胞株，并分时间段加入四环（邋ＤＯＸ）来诱导脚２＂的表达，通过ｑＲＴ－ＰＣＲ分析Ｅｓｒｒｂ的表达情况。结果示，的表达量随着四环素诱导时间的延长而逐渐上升（Ｆｉｇ．邋２Ａ）。逡逑第二，我们为了确定７７ｃｐ２／／的下调，Ｅｓｒｒｂ表达如何，，我们构建了邋Ｔｆｃｐ２慢病毒质粒的细胞0１１７７＃２＂妫＃７邋ｆ／７．ｖＭ２），并通过ｑＲＴ－ＰＣＲ检测，发现ｒ＃表达量下降了邋７０－８０％，而的表达量也随着下降了（Ｆｉｇ．邋２Ｂ）。逡逑以上说明在转录水平上，；刀／可以调控的表达。逡逑
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q132

【相似文献】