胞内劳森菌LI1035靶向酵母和哺乳动物的MAPK通路并调节其肌动蛋白组成

发布时间：2020-05-09 14:36

【摘要】：胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)是一种新的专性胞内寄生革兰氏阴性细菌,被鉴定为多种动物(主要是猪)的传染性疾病增殖性肠病(PE)的病原。胞内劳森菌基因组序列表明其具有III型分泌系统(T3SS),在细菌入侵和逃避宿主固有免疫系统的过程中起辅助作用,是诱导细胞增殖的机制之一。T3SS(T3ES)通常以保守的真核细胞过程为目标,而T3ES在胞内分泌的效应因子尚未见报道。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一个已建立的成熟的模型系统用于揭示其功能,通常在实验室中分析病原体特异性基因产物的功能。通过酿酒酵母菌株表达进行细胞内所有假想基因的生长抑制筛选,首次发现LI1035具有抑制酵母生长的作用。14株丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated proteinkinase,MAPK)酵母单倍体缺失株中,有2株恢复LI1035对细胞生长的抑制作用,提示LI1035与酵母中MAPK通路的组分相互作用。磷酸化分析证实LI1035在酵母和哺乳动物细胞中抑制MAPK信号通路。肌动蛋白染色分析表明,LI1035调节酵母和哺乳动物细胞的肌动蛋白组织。胞内劳森菌LI1035作为假定的效应蛋白会改变MAPK途径,调节宿主的肌动蛋白组织。为了确定外源蛋白在酿酒酵母细胞中的共定位提供参考,构建酿酒酵母荧光定位报告菌株。运用染色体同源重组的方法,将突变的、已进行酵母表达优化红色荧光蛋白RedStar整合到12个酵母细胞器标记蛋白的C端,与之进行融合表达,用特异性引物对每一个酵母荧光定位报告菌株进行菌落PCR验证,用激光共聚焦显微镜进行荧光检测和形态特征观察,对线粒体和细胞核进行了特异性染料染色,用GFP标记沙门氏菌已知定位蛋白SipA,与构建的相应荧光定位报告菌株进行共定位。构建的酿酒酵母荧光定位报告菌株可分别标示酵母细胞的内质网、过氧化物酶体、脂滴、初级内吞体、次级内吞体、顺式高尔基体、反式高尔基体及线粒体。菌落PCR、荧光检测、染料与相应报告菌株的共定位、已知定位蛋白SipA与相应报告菌株的共定位均提示报告菌株构建成功。这些报告菌株的构建,为日后在酵母中观察细胞器动态变化,以及未知蛋白在酵母中的定位提供了基础性工具。
【图文】：

图 1-1 胞内劳森菌电镜图wsonia intracellularis of electron mic（需要消耗宿主线粒体三磷酸盐培养[30]。该菌分离培养的条件内劳森氏菌。国外也仅有少数菌的体外培养最初是在单层小环境，37℃培养），，目前常在 37共培养[31]。具有单极鞭毛，从感染的肠细 GC 值、小基因组以及热休克生体中。该菌大量定植在未成有关[33]。侵入上皮细胞的细菌非吸收溶质会导致渗出性或吸吸收能力下降，对饲料利用率基因的激活时，被感染的肠上

森菌 LI1035 靶向酵母和哺乳动物的 MAPK 通路并调节其肌动蛋白组体内感染过程的致病机理的认识，因此目前对该菌的致病机界上成功分离得到 17 株胞内劳森菌，NCBI 上传有 PHE/MN登录号 PRJNA183）和 N343（2013 年 1 月上传，登录号 PRJN内劳森菌分离株的全基因组序列，分别注释 1419 和 1421 种被注释为具有未知功能的假设 ORF，且两分离株在基因组]。该基因组序列包括一个小的单基因组 1.46 Mb 环形染色体及个质粒，总长约 1.72×106bp，预计编码 1340 个基因（27.3]，共 366 个为功能未知蛋白。基因组序列分析表明该菌存在Ⅲ型分泌系统[42-43]。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

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本文编号：2656289