HOXC10启动子区域G-四链体结构的鉴定及功能的研究

发布时间：2020-05-12 02:09

【摘要】：作为Homeobox家族中的一员,HOXC10在哺乳动物的细胞分化和胚胎发育中起着重要的作用。越来越多的证据表明HOXC10在肿瘤的发生发展中具有调节作用,但关于HOXC10基因自身的表达调节相对被忽略。在本研究中,我们发现在HOXC10启动子的反义链上存在多个连续的鸟嘌呤序列,并且利用G-四链体预测网站发现每个多鸟嘌呤序列之间具有较高的形成G-quadreplex(G-四链体)结构的潜力。针对有高潜力形成G-四链体的区域利用化学合成方法体外合成该区域对应的寡核苷酸单链,通过圆二色谱实验分析并确定该区域存在的多个连续的鸟嘌呤序列在特定的波长处呈现G-四链体结构所展现的特定摩尔椭圆率,明确了 HOXC10启动子区域存在G-四链体结构。进一步通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳展示该区域在一定浓度的氯化钾溶液中能够形成分子内的G-四链体结构。将寡核苷酸单链用转染试剂转入人的宫颈癌HeLa细胞中,用G-四链体的抗体BG4做免疫荧光检测到荧光信号,证实寡核苷酸单链在癌细胞自身内环境中也可以形成G-四链体结构。将HOXC10转录起始位点上游2 000 bp的核苷酸序列通过PCR方法克隆到高斯荧光素酶报告载体中,并将能够形成G-四链体结构的区域进行点突变或缺失突变,将不同的报告载体转染到HeLa细胞中,利用发光底物检测高斯荧光素酶表达情况。结果显示G-四链体结构缺失或突变能够改变HOXC10启动子下游的高斯萤光素酶表达。据已报道文献记载,G-四链体结构的打开需要解旋酶的调控,本研究分析了759个乳腺癌病人样本,发现具有DNA解旋酶活性的染色质重塑蛋白CHD7与HOXC10基因的表达呈正相关,通过荧光素酶报告载体及CHD7表达干扰实验发现解旋酶CHD7能够解开HOXC10启动子中的G-四链体结构并增强其基因表达。综上实验结果,HOXC10启动子的G-rich区域能够形成G-四链体结构,并且能够被解旋酶CHD7解旋进而调控HOXC10基因表达。
【图文】：

逑三个以上的分子内或分子间的平面四链体，每个平面的鸟嘌呤之间通过Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ氢键稳定逡逑其结构［１７］，其中相邻鸟嘌呤之间相对大约旋转９０°邋（图１）邋［｜８］，中间位置为金属阳离子，四逡逑周的４个鸟嘌呤之间通过Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ氢键连接。一些金属阳离子缓冲溶液能够稳定Ｇ－四链逡逑体结构，其稳定性顺序为Ｋ＋＞Ｎａ＋＞ＮＨ４＋＞Ｌｉ＋ｔｌ９］。目前研宄者提出多种不同的算法来预测候逡逑选序列形成Ｇ－四链体结构的潜能［２（Ｗ３］。在各种生化技术如圆二色谱、ＮＭＲ光谱、非变性聚逡逑丙烯酰胺凝胶电泳等的帮助下，通过化学合成方法将内源性启动子的鸟嘌呤富集区合成寡核逡逑苷酸单链，证明了邋Ｇ－四链体结构可以在体外形成［１７］。逡逑丫＇逡逑）—（／ｈ逡逑ｙＷＨ逡逑Ｈ逡逑图１邋Ｇ－四链体结构平面图逡逑中间位置为金属阳离子，四周的４个鸟嘌呤之间通过Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ氢键连接。逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ逡逑Ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ邋ｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅｔａｌ邋ｃａｔｉｏｎ，邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｆｏｕｒ邋ｇｕａｎｉｎｅｓ邋ａｒｏｕｎｄ邋ｉｔ邋ａｒｅ邋ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ逡逑ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｂｏｎｄ．逡逑１．２．１邋Ｇ－四链体结构的功能逡逑研宄发现，Ｇ－四链体结构广泛分布于酿酒酵母细胞中和人类基因组上，尤其是在哺乳逡逑动物中许多基因的Ｇ－四链体结构区域是进化保守的［２４￣２６］。并且大数据运算发现，，在人类基逡逑因组上存在的潜在Ｇ－四链体结构形成位点超过３０万个［２５］。这些潜在的Ｇ－四链体结构在调逡逑控的关键位点分布较多

在基因的启动子区域中，Ｇ－四链体结构可以在其正义链或负义链中形成。本研宄检测逡逑了人类ＨＯＸＣ１０基因的启动子区域，发现在ＨＯＸＣ１０基因临近转录起始位点的启动子区域逡逑存在胞嘧啶富集区，见图３－１，胞嘧啶富集区域为红色部分，而其互补链就正好存在着（Ｇ＞逡逑ｓＮ＾ＧｇＮ＾Ｇ＾Ｎ＾Ｇ＾）。将转录起始位点上游的第一个核苷酸定义为“－１”时，在－２９５和－逡逑２７２之间存在着连续４组５个胞嚼啶连续出现的情况，而其反向互补链则存在着连续４组５逡逑个鸟嘌呤连续出现的情况
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q75

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本文编号：2659455