当前位置:主页 > 理工论文 > 生物学论文 >

酿酒酵母中DNA复制检验点中介蛋白Mrcl及其与DNA复合物的结构研究

发布时间:2020-05-13 05:45
【摘要】:物种要延续下去,保存遗传信息并将其完整无误地传递给后代是十分重要的。这一过程依赖于完整可靠的DNA复制过程。DNA复制过程如果变得不稳定或者失去控制,无法保证各类遗传信息的正确传递和表达,就会造成生物体的各种缺陷及包括癌症在内的各类疾病甚至死亡。生物体已经拥有了一套强大完整的DNA复制体系来完成遗传物质的传递。但是复杂的体系也会有失灵的风险,为了应对这些风险,生物体配置了对应的DNA复制检验点机制以及修复机制。复制检验点维持真核细胞的基因组稳定性。在每一个周期的基因组复制过程中,细胞不可避免地受到内源性或外源性复制应激的挑战,包括异常的DNA结构、DNA损伤、蛋白质阻碍、癌基因诱导的异常复制、dNTP或组蛋白供应不足、复制转录冲突等等。复制检验点又称S期检验点,它帮助细胞应对上述挑战,确保在整个基因组复制前进行正确的复制叉进程。除了复制基因组外,DNA复制叉还为许多在DNA复制检查点起作用的信号蛋白提供了一个组装平台。在酿酒酵母中,Mec1在DNA复制检验点通路中处于核心地位,它参与感知停滞的DNA复制叉,是哺乳动物细胞中ATR的同源蛋白。Ddc2(哺乳动物ATRIP同源蛋白)作为Mec1的调节亚单位,与Mec1形成蛋白质复合物。Mec1-Ddc2复合物通过复制蛋白A(RPA)包裹的单链DNA被招募到停滞的复制叉处。Hus1、Rad1和Rad9是复制检查点所需的另外三种蛋白质,它们形成的三聚体复合物与PCNA较为相似。这个三聚体在酿酒酵母中的同源物是Mec3-Rad1-Ddc1。复制检查点的另一个必要因素是Rad17(酿酒酵母中为Rad24),它类似于一个RFC亚单位,并且与RFCs2-5结合形成复合物。有人提出,与PCNA和RFCs1-5类似,Rad24-RFC复合体将Mec3-Rad17-Ddc1复合体加载到DNA损坏或复制受阻的位置。一旦被加载,Mec3-Rad17-Ddc1复合物会激活Mec1。Mrc1(mediator of replication checkpoint)是DNA复制体的一个组成部分,在DNA合成过程中随复制叉沿着染色体移动。MRC1的缺失导致DNA复制缺陷,表明其在DNA复制的正常进展中的作用。同时,Mrc1也参与酿酒酵母和裂殖酵母细胞对羟基脲的反应。当DNA复制被羟基脲阻断时,Mrc1会经历Mec1和Rad3(Mec1的S.Pombe同源蛋白)依赖的磷酸化,Mrc1作为中介体,参与将复制应激信号从Mec1传递到Rad53效应激酶的过程。而在这个过程中,Rad24-RFC同样起着重要作用,可能参与调节Mrc1的磷酸化。有文献报道,磷酸化的Mrc1会将Mec1对Rad53的激活效率提高70倍左右。尽管人们对Mrc1在复制检查点中的作用进行过许多研究,然而,Mrc1的结构特征如何,与DNA有怎样的相互作用,与Rad24-RFC存在着怎样的相互作用且两者的相互作用受何种因素影响,这些问题都还没有任何信息。为了解决这一问题,我首先尝试在酿酒酵母S.cerevisiae中内源纯化Mrc1,通过酵母同源重组的方法改造基因组,在目的基因后加入TAPm标签,再通过亲和层析的方法获得Mrc1。但由于体内与Mrc1相互作用的蛋白很多,且Mrc1的本底表达水平较低,这种本底表达后内源纯化的策略很不适用。幸运的是,我们获得了来自中国农业大学楼慧强实验室的馈赠——pGEX-4T-3-Mrc1重组表达质粒,可以在大肠杆菌重组表达系统中较好地表达全长的Mrc1。此外,我又在大肠杆菌中重组表达了酿酒酵母截短的Mrc1,获得了质量较好的Mrc1(287-1096AA)。我们利用体外孵育,得到了Mrc1(287-1096AA)与5' flap DNA的复合物。通过电镜三维重构的方法,我们解析了 Mrc1的第一个负染电镜结构,了解到Mrc1是一个接近环状的中介体蛋白,它可以将DNA“握住”,作为复制体的一部分,沿着DNA滑动。另外,我们还重组表达了Mrc1(1-567AA),将其与5' flap DNA进行了体外孵育,通过电镜分析发现,截短后的Mrc1,无论是Mrc1(287-1096AA)还是Mrc1(1-567AA),与DNA的亲和力都有明显提高,这可能是截短后Mrc1的DNA结合区域暴露出来的缘故。我们由此猜测,Mrc1的C端与N端之间存在一种别构调节,当C端与N端相互作用形成后,会别构抑制C端一侧的DBD与DNA的亲和力。DNA的正确顺利复制是保证遗传信息稳定性的关键步骤,复制体如何结合DNA,产生复制压力后复制体如何响应并传递信号到下游通路,这是一个极其重要的课题。本文的工作以中介体蛋白Mrc1为切入点,通过电镜分析,阐述了Mrc1作为复制体的一部分,它整体趋于环状中心有孔洞的结构特征、且通过中心孔洞与DNA的结合及它与clamp loader Rad24-RFC的相互作用,更加丰富地认识了 Mrc1在DNA复制及复制压力应激反应中所发挥的作用,丰富了人们对复制叉行进及复制检验点的认识。
【图文】:

示意图,真核生物,细胞周期,调控过程


图1-1真核生物复制起始过程示意图(0,邋Donnell邋et邋al.,20l3)逡逑注:真核生物通过将起始事件分为细胞周期的不同阶段,并对DNA复制的起始机种调控过程,达到了精细的控制水平。Pre-RC的形成发生在快速增殖的真核细胞结束期间或细胞周期的G1期,但MCM2-7螺旋酶在加载到dsDNA后仍然不活跃。叉的建立是由多种因子(最重要的是CDC45和GINS.)的染色质结合来调节的,够激活MCM2-7螺旋酶活性。在S期,CDC6和CDT1蛋白通过选择性蛋白降解或除,从而阻止了邋MCM2-7在S期的进一步加载和再活化。复制原点是由MCM2-7结束期或G1期加载,然后在S期激活。通过将螺旋酶加载和DNA合成步骤分为两个不同阶段,真核生物阻止复制原点多次启动。复制后,细胞进入G2期,然。逡逑3逡逑

模型图,冈崎片段,图注,图片说明


V邋strand逡逑.魏逡逑图1-2真核生物复制叉组分示意图(O’邋Donnell邋et邋aL,邋2013)逡逑图注:图片提出了一种真核生物复制体的结构。MCM2-7螺旋酶围绕着主链,,通过与GINS和逡逑CDC45结合起来形成CMG复合体,对DNA双链进行解旋。RFC邋clamp邋loader反复将PCNA邋(增殖逡逑细胞核抗原)clamp加载到由Pol邋a-primase形成的滞后链引物上。与大肠杆菌不同,clamp逡逑4逡逑
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:Q75

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘敏;;基于科学思维的“DNA是主要的遗传物质”教学设计[J];教育观察;2019年30期

2 刘涛;;关于几种植物材料DNA含量差异性的研究[J];中学生物学;2019年03期

3 陈从周;;DNA折纸术——全编程的信息工具[J];广州大学学报(自然科学版);2019年01期

4 Jiaojiao Zhang;Feng Li;Dayong Yang;;DNA: From Carrier of Genetic Information to Polymeric Materials[J];Transactions of Tianjin University;2019年04期

5 赵海燕;石晓龙;;DNA Tile 计算简述[J];广州大学学报(自然科学版);2019年02期

6 王豆;许冠;王洪永;何森;卜书海;郑雪莉;;中国圈养林麝微卫星DNA多样性研究[J];兽类学报;2019年06期

7 王若湛;;探讨DNA鉴定技术在法医物证学中的应用[J];世界最新医学信息文摘;2019年85期

8 李文送;;DNA甲基化及其生物学功能[J];生物学教学;2014年09期

9 刘庆华;茹慧香;;“DNA是主要的遗传物质”教学设计[J];中学生物教学;2016年07期

10 丁思思;袁华;罗小虎;李高峰;;植物DNA粗提取与鉴定的简便方法[J];中学生物教学;2016年19期

相关会议论文 前10条

1 刘冰;王旭;赵梦真;晁洁;樊春海;;基于DNA折纸术的纳米金棒精密修饰[A];中国化学会第30届学术年会摘要集-第二十八分会:化学生物学[C];2016年

2 刘冬生;李闯;程恩隽;邢永政;金娟;;DNA超分子水凝胶及其应用[A];中国化学会第30届学术年会摘要集-第二十四分会:超分子组装与软物质材料[C];2016年

3 Kaiying Cheng;Hong Xu;Xuanyi Chen;Liangyan Wang;Bing Tian;Ye Zhao;Yuejin Hua;;Structural basis for DNA 5′-end resection by RecJ[A];第五届中国结构生物学学术讨论会摘要集[C];2016年

4 陈南迪;覃诗雅;羊小海;王青;翦立新;王柯敏;;“传感-治疗”的DNA纳米装置在协同杀伤循环肿瘤细胞的应用[A];中国化学会第30届学术年会摘要集-第三十八分会:纳米生物效应与纳米药物化学[C];2016年

5 刘晔华;陈锦艳;江雁;张坚磊;穆红;;磁珠法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA的评价[A];第七届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编[C];2016年

6 谭磊;孙悦;周湘;刘伟;;多头蚴核糖体DNA及线粒体DNA多态性研究[A];中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会论文集[C];2015年

7 叶俏;沈洁;严婷婷;王宙政;;原发性干燥综合征患者血浆循环DNA与疾病活动相关性研究[A];2015年浙江省风湿病学学术年会论文汇编[C];2015年

8 周嘉嘉;FriederikeSchmid;;计算模拟研究DNA和聚电解质的结合[A];2015年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——主题E 高分子理论计算模拟[C];2015年

9 Yuan Zhang;Yanlong Chen;Gaigai Xu;Chen Lan;Shaige Xia;Wenjie Zhao;Shusheng Zhang;;Endogenous DNA adducts method establishment and Human Biomonitoring[A];河南省化学会2016年学术年会论文摘要集[C];2016年

10 孙觅;辛丽斐;刘宏;;基于浓差电池原理高灵敏检测DNA的传感器[A];中国化学会第30届学术年会摘要集-第四分会:生物分析和生物传感[C];2016年

相关重要报纸文章 前10条

1 亚尼弗·埃利奇 本报记者 沈春蕾 整理;DNA:有望成为终极存储技术[N];中国科学报;2020年

2 黄辛;DNA骨架硫修饰研究又获新成果[N];科学时报;2011年

3 本报记者 辛明;邓亚军:灾难现场的DNA斗士[N];中国青年报;2011年

4 本报记者 欧阳晓红 韩宋辉;“可怕”的友邦DNA 267亿港元净利从何而来[N];经济观察报;2015年

5 实习记者 于紫月;寻找治癌“灵丹妙药” 染色体外环状DNA或是关键所在[N];科技日报;2020年

6 深圳特区报首席记者 孙锦;解读DNA惠及世界患癌儿童[N];深圳特区报;2018年

7 记者 冯卫东;DNA分子计算为可编程药丸铺路[N];科技日报;2018年

8 本报记者 李禾;DNA折纸术,“折”出生命所需神奇图案[N];科技日报;2019年

9 记者 刘霞;美日创建迄今最大DNA基因模型[N];科技日报;2019年

10 任芳言;古DNA揭示马的身世[N];中国科学报;2019年

相关博士学位论文 前10条

1 卢沙沙;DNA纳米技术在生物传感及智能水凝胶中的应用[D];中国科学技术大学;2019年

2 丁健生;基于母子细胞系及其酶消化的胎儿染色体非整倍体无创产前检测游离DNA参考物质的研究[D];北京协和医学院;2019年

3 谢斯思;基于TALE组装的DNA支架增强外源多酶代谢通路[D];国防科技大学;2018年

4 李翔;级联循环和酶催化下的DNA反应网络[D];中国科学技术大学;2019年

5 刘升;酵母DNA损伤响应中ATR激酶及其相关复合物的结构研究[D];中国科学技术大学;2019年

6 管莎莎;肿瘤及外周血循环DNA检测在转移性胰腺癌中的临床应用价值[D];中国人民解放军医学院;2019年

7 王路;利用DNA条形码与形态相结合的方法对亚历山大塔玛复合种和夜光藻的内共生绿藻进行系统分类学研究[D];厦门大学;2017年

8 郑心如;DNA双链断裂修复调控蛋白筛选及调控机制研究[D];厦门大学;2017年

9 李根;转录因子与DNA特异性识别机制的分子动力学模拟研究[D];华中农业大学;2019年

10 别丽华;bZIP转录因子与DNA相互作用中甲基化调控机制的分子模拟[D];华中农业大学;2018年

相关硕士学位论文 前10条

1 李朦朦;基于杂交链式反应的DNA荧光传感器阵列的研究[D];湘潭大学;2019年

2 魏细姣;基于分子信标的DNA荧光传感器阵列的研究[D];湘潭大学;2019年

3 姚志军;DNA键合作用对三维纳米结构构建的影响[D];湘潭大学;2019年

4 张金芝;基于DNA链杂交反应的生物传感器的研究及应用[D];湘潭大学;2019年

5 付燕红;《人的性格由DNA决定》(节选)翻译实践报告[D];四川外国语大学;2019年

6 陈雨;DNA功能化的金纳米组装体对电离辐射响应的研究[D];南京航空航天大学;2019年

7 王瑞;基于光谱学和分子模拟技术研究几种食品添加剂与蛋白质、DNA的相互作用[D];南昌大学;2019年

8 李秋莎;DNA非经典结构的小分子识别及应用研究[D];浙江师范大学;2019年

9 刘利;基于DNA四面体介导的纳米生物传感器双模检测miRNA-21[D];南京邮电大学;2019年

10 高梓童;中成药的DNA条形码鉴定:从mini-barcode到meta-barcode[D];北京协和医学院;2019年



本文编号:2661493

资料下载
论文发表

本文链接:https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2661493.html


Copyright(c)文论论文网All Rights Reserved | 网站地图 |

版权申明:资料由用户6d2ce***提供,本站仅收录摘要或目录,作者需要删除请E-mail邮箱bigeng88@qq.com