猪食欲肽受体2突变体真核表达载体的构建及药理学特性初探

发布时间：2020-05-16 02:51

【摘要】：食欲肽(Orexins)包括食欲肽 A(Orexin A,OXA)和食欲肽 B(Orexin B,OXB),是一种主要由下丘脑和下丘脑外侧中枢神经元合成的神经肽。其与食欲肽受体1(Orexin 1 receptor,OX1R)和食欲肽受体2(Orexin2 receptor,OX2R)发生结合参与调控摄食、睡眠与觉醒、能量代谢和神经内分泌稳态等活动。然而目前,关于食欲肽及食欲肽受体的研究主要集中在人上,关于猪OX2R(pOX2R)以及其突变型的生理活性的研究较少。为了更进一步的研究pOX2R的生理功能,了解配体作用受体后胞内的信号转导特性,进而为育种优化等提供依据,本研究以实验室已构建的pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-WT质粒为模板,根据已有文献中基因多态性与信号转导的关系选择了 P10S、P11T、V3081和T401I四个突变体;利用单点突变技术成功构建四个突变体的真核表达载体,再将pOX2R突变体真核表达载体与野生型(Wild type,WT)真核表达载体分别转染入HEK293T细胞中,Western blot技术验证其是否能在体外细胞中正常表达;利用双报告基因法检测WT与突变体在不同浓度配体刺激下胞内总环磷酸酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)白的表达水平;利用Western blot的方法评价高浓度激动剂下对WT与突变体下游磷酸化细胞外调节蛋白激酶 1/2(Phosphorylated extracellular regulated protein kinases1/2,p-ERK1/2)、磷酸化p38和磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(Phosphorylated cAMP-response element bindingprotein,p-CREB)的表达的影响,以此研究pOX2R的生理功能。主要研究结果如下:1、以构建好的pOX2R WT真核表达载体pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-WT为模板,利用定点突变技术成功构建四个突变体。将构建好的四种突变体分别命名为pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P10S、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P11T、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-V308I 和pcDN A3.1(+)-myc/pOX2 R-T401I。2、将构建好的突变体与WT质粒分别转染入HEK293T细胞中,转染后24 h提取细胞总蛋白,利用Western blot技术验证其在细胞中的表达。结果显示,pOX2R的WT与四个突变体在细胞中均能够顺利表达。3、将pOX2R WT与四个突变体真核表达载体分别与萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK按照2:10:1的比例共转染入HEK293T细胞中,检测细胞内基础cAMP水平。结果显示四个突变体的胞内基础cAMP水平与WT相比无显著差异。采用不同浓度(10-6M-10-10M)的OXA和OXB分别对表达WT和四个突变体pOX2R的细胞进行刺激。研究结果表明,不管是pOX2R WT还是突变体,胞内的cAMP水平呈现明显的剂量效应关系。相比于WT,突变体P10S、P11T和T401I对相同浓度激动剂OXA的响应显著下降。在相同浓度激动剂OXB刺激下,只有突变体P11T与WT相比灵敏度显著降低。上述结果表明,第10、11和401位氨基酸的突变均能对胞内的PKA通路产生影响。4、将pOX2R WT与突变体分别瞬时转染入HEK293T细胞中,10-6 M OXB和10-7 M OXA分别进行刺激,提取总蛋白,利用Westernblot技术检测p-ERK1/2、p-p38和p-CREB的蛋白表达水平。结果表明,在OXA和OXB诱导下,四个突变体胞内p-CREB表达水平与WT相比均显著下降;与WT相比,在OXA的刺激下,突变体V3081的p-ERK1/2显著降低,突变体P10S、P11T和V308I的p38磷酸化水平显著降低;在配体OXB诱导下,突变体T401I胞内p-ERK/2水平显著降低,突变体P11T的p-p38水平显著降低。上述结果表明,这四个位点的突变能对PKC及MAPK通路产生影响。
【图文】：

信号,抑制蛋白,信号传导,激酶

１．３．２支架蛋白介导的信号转导逡逑ＧＰＣＲ信号支架蛋白也是ＧＰＣＲ信号调节的关键部分，可以参与更加复杂高级的信号逡逑转导（图１．１）。ＧＰＣＲ支架蛋白主要分为三类，第一种是含有ＰＤＺ结构域支架蛋白，它能逡逑与ＧＰＣＲ胞内的羧基端结合，将ＧＰＣＲ与各种激酶（ＰＫＣ，ＰＬＣ），离子通道偶联。逡逑第二种是非ＰＤＺ结构域支架蛋白，包括Ａ型激酶锚定蛋白，ＰＫＡ等，能调节ＧＰＣＲ逡逑信号。逡逑最后一种是抑制蛋白，如ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎｓ。目前，与ＧＰＣＲ相互作用的蛋白中研究最多的逡逑就是抑制蛋白，它可以作为ＧＰＣＲ信号传导的负调节因子，使得活化的受体与Ｇ蛋白解离逡逑（信号传导脱敏）或介导ＧＰＣＲ内化，亦能直接以一种不依赖Ｇ蛋白的形式介导ＧＰＣＲ与逡逑胞内信号分子之间的作用［３６］。逡逑

示意图,信号,示意图,钙离子

两种食欲肽和两种受体亚型的存在必然会使得细胞信号传导途径具有多样性。ＯＸＡ或逡逑ＯＸＢ与０Ｘ１Ｒ或０Ｘ２Ｒ的结合能够同时激活Ｇｑ，Ｇ＃ＧＳ这三种亚基，其随后诱导ＰＬＣ，逡逑ＰＬＡ，ＰＬＤ或ＡＣ的活化，最终导致细胞内Ｃａ２＋增加和下游级联反应（图１．４）邋［４７，６比之前逡逑的观点认为钙离子水平的变化主要由ＧＰＣＲ介导，，而现有的研究表明ＯＸＲ活化后，作用逡逑于非选择性的阳离子通道（ＮＳＣＣ）使得钙离子水平升高［６２，６３］。研宄表明，在中枢神经系统逡逑中，食欲肽受体活化后激活非选择性阳离子通道，抑制钾离子通道和使得钠钙离子发生交逡逑换，产生神经兴奋，也可通过突触前作用刺激神经递质的释放并调节突触ｔ６４，６５］。食欲肽的逡逑信号转导还涉及到外周如脂肪组织，肠神经系统，肾上腺和胰腺。体外研宄表明，食欲肽逡逑增加粘膜下神经丛的运动，可能通过Ｇｓ／ｃＡＭＰ／ＣＲＥＢ级联引起ｐ－ＣＲＥＢ的上调，亦能通过逡逑ｐ３８邋ＭＡＰＫ信号影响前脂肪细胞的分化过程。逡逑Ｐｕｔｕｌａ等人探索了表达０Ｘ１Ｒ的ＨＥＫ２９３细胞和Ｎｅｕｒｏ－２ａ细胞中食欲肽刺激受体后产逡逑生的信号传导［４７］。结果表明，ＯＸＡ刺激０Ｘ１Ｒ后，释放２－花生四烯酸，以时间依赖性和逡逑浓度依赖性活化ｐ３８和ＥＲＫ１／２
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

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