出芽短梗霉中普鲁兰多糖合成相关基因的分析及comp1961基因的克隆表达

发布时间：2020-05-16 03:49

【摘要】：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans NG)合成并分泌普鲁兰多糖,普鲁兰多糖合成的分子机制尚不清楚。本试验的目的是寻找出芽短梗霉中普鲁兰多糖合成途径中的关键基因,初步探索普鲁兰多糖的合成机制。前期研究通过转录组数据推测15个糖代谢基因可能和普鲁兰多糖合成相关。本试验利用实时定量PCR对这些基因的转录水平进行检测,检测结果与转录组测定数据一致,证明了转录组数据可靠性。本研究检测了出芽短梗霉发酵过程中菌体生物量、胞内糖原、胞外普鲁兰多糖含量、15个候选基因转录水平的变化规律。对基因comp1961进行生物信息学分析和结构预测,构建工程菌pPIC9K-1961/GS115,在毕赤酵母中进行异源表达。结果如下:(1)在YPD培养基中,出芽短梗霉生长迅速并且在第3天达到了最大值,随后菌体生物量逐渐降低并在后期趋于平稳;普鲁兰多糖的含量在第5天达了到最大值,随后含量逐渐降低;细胞内糖原含量在第二天最高然后逐渐降低,细胞内糖原含量和普鲁兰多糖含量呈负相关,推测糖原的合成可能和普鲁兰多糖的合成相关。(2)在高产糖培养基YPD的培养条件下,利用实时定量PCR对出芽短梗霉中这15个基因在不同培养时间点的转录水平进行检测,从而分析这15个基因和普鲁兰多糖合成的关系。实时定量结果发现基因代码为comp3609,comp9920,comp9549,comp7480,comp3824,comp3260,comp1482的表达量在整个过程中相对较低,基因代码为comp9219,comp1961的表达量相对较高,基因代码为comp7877,comp7023,comp7120,comp6817,comp5441的基因在36-72 h间表达量较高,基因代码为comp4798的基因在72 h后表达量较高。(3)生物信息学软件预测该蛋白是亲水性蛋白,具有α-淀粉酶结构域。根据转录组中相关序列信息扩增comp1961基因,成功构建克隆及表达载体,通过SDS-PAGE和Western Blot验证重组蛋白在毕赤酵母中成功表达,经检测目的蛋白不能水解淀粉或糖原。研究发现将α-淀粉酶在普鲁兰多糖合成过程中发挥重要作用,本实验室在进行转录组数据分析时发现comp1961的表达量显著上调,推测comp1961在普鲁兰多糖的合成发挥着重要作用。通过体外克隆表达comp1961基因并成功表达,但是体外并没有检测到淀粉酶活性。本研究结合前人的研究和转录组数据分析,提出一种可能的普鲁兰多糖合成途径。但是体外验证酶活性却未成功,下一步欲利用基因敲除的方法将comp1961基因敲除,检测胞内糖原的含量和胞外普鲁兰多糖的产量,以验证推论是否正确。
【图文】：

5个候

熔解曲线

3 comp7480 comp787719 comp9549 comp9920图 2-1 15 个候选基因的熔解曲线Fig. 2-1 The melt curve of 15 candidate genes实时定量结果
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q93;Q78

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