香鳞毛蕨MYC2基因的克隆及功能分析

发布时间：2020-05-19 20:51

【摘要】：香鳞毛蕨[Dryopteris fragrans(L.)Schott]是生长在高寒地区的一种鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物,在民间,用香鳞毛蕨叶片来治疗皮肤病已具有几十年的历史,香鳞毛蕨作为一种野生药用资源植物,具有重要的应用前景。近年来研究表明,香鳞毛蕨中具有酚类、萜类等多种化合物。本实验室前期的工作已经证明,香鳞毛蕨的萜类代谢产物具有抑菌和抗肿瘤等功效。但目前关于蕨类植物的萜类代谢途径还未见报道。因此,对香鳞毛蕨及其萜类代谢通路的研究具有重大意义。植物中萜类物质的生物合成在很大程度上受到昆虫或微生物诱导。生产实践中,经常采用外源施加茉莉酸类物质,来模拟昆虫与真菌病害以诱导植物的间接防御反应来研究萜类代谢产物的积累。MYC2是植物响应茉莉酸类代谢通路中重要的转录因子,在调控植物体积累萜类物质等次生代谢产物和诱导植物防御反应中具有重要的作用。因此,本研究以茉莉酸类激素JAs作为外源激素处理香鳞毛蕨叶片,调控香鳞毛蕨MYC2转录因子的表达,并通过香鳞毛蕨MYC2在拟南芥中的异源表达来探究香鳞毛蕨萜类代谢途径。本文主要的试验结果如下:1.从试验室之前获得的香鳞毛蕨全株系转录组数据库中找到注释为MYC2基因的片段。从4个基因片段中筛选出一个作为香鳞毛蕨MYC2基因的核心片段。基于核心片段序列,通过RACE技术,克隆获得基因全长3130bp,开放阅读框2496bp,将其命名为DfMYC2,在NCBI上的基因登录号为MK193871。2.选取香鳞毛蕨根、根状茎、叶柄及叶片对DfMYC2基因进行表达量分析,结果显示其在叶片中表达量最高,叶柄表达量其次,在根和根状茎中表达量最低。之后选用MeJA对香鳞毛蕨进行外源处理,结果显示,香鳞毛蕨MYC2基因在MeJA处理后随时间变化表达量先升高后降低。3.运用生物信息学技术分析并预测香鳞毛蕨MYC2蛋白的一级结构、二级结构、三级结构等信息。结果发现香鳞毛蕨MYC2蛋白编码831个氨基酸,包含三种二级结构类型,存在信号肽,属于分泌型蛋白,不存在卷曲结构和信号肽。4.构建植物表达载体对拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型植株(哥伦比亚生态型Col-0)进行遗传转化,获得DfMYC2基因过表达植株,观察其表型,发现过表达植株要比同期的野生型植株生长更茂盛,说明DfMYC2基因表达能够促进拟南芥植株的生长;过表达植株叶柄上的表皮毛数量明显多于野生型植株,且在过表达拟南芥植株中倍半萜合酶基因TPS11和TPS21表达量升高,证明DfMYC2基因在拟南芥中同样能够促进倍半萜合酶基因的表达。5.通过CRISPR/Cas9技术获得拟南芥AtMYC2基因缺失型植株,对其进行筛选并观察表型。结果显示AtMYC2基因缺失型植株要比同期的野生型拟南芥生长更慢且叶柄上的表皮毛数量明显减少,且缺失型植株中倍半萜合酶基因TPS11和TPS21表达量明显降低,说明AtMYC2基因不仅影响拟南芥植株生长和表皮毛发育,还影响倍半萜合酶基因的表达。6.将DfMYC2基因转入到AtMYC2缺失型纯合体,获得DfMYC2互补AtMYC2缺失型拟南芥。结果发现,互补型植株TPS11和TPS21基因表达量比缺失型植株略有升高,但比野生型低,植株大小和表皮毛数量与野生型植株没有明显差异,说明DfMYC2基因和AtMYC2基因在植物生长、表皮毛发育和影响倍半萜代谢积累的相关功能上有相似之处。7.将DfMYC2基因转入到本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中进行亚细胞定位分析,结果发现DfMYC2基因主要在细胞核中表达。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2;S567.239

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本文编号：2671465