水稻粒型调控基因OsUBP15的图位克隆与功能分析
发布时间：2020-05-20 07:45
【摘要】：水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物。水稻粒型的研究对培育高产优质的水稻品种具有重要的意义。水稻的粒型包括粒宽、粒长和粒厚,它们在很大程度上影响水稻籽粒的粒重,最终影响水稻的产量。同时,粒型也是一个重要的品质性状,它影响到稻米的外观品质、加工品质和食用品质。尽管目前已经克隆出部分控制水稻粒型的基因,但是由于粒型是一个复杂性状,其遗传调控网络仍然有待阐明,需要发掘和克隆更多的粒型调控基因,并研究它们的互作关系。本研究中,通过对来自于粳稻品种Kitaake组织培养的宽粒突变体lg1-D(large grain1-D)的图位克隆,发现了编码一个泛素特异性蛋白酶OsUBP15的编码基因参与了粒型的形成,并对OsUBP15基因进行了功能分析。具体结果如下:1.与野生型相比,突变体lg1-D籽粒的粒宽、粒长和粒厚分别增加了30.8%、13.23%、13.8%,千粒重增加了30%以上。株高有所降低、穗长缩短,株型和穗型变得直立,分蘖数和穗粒数有所减少,单株产量没有显著的变化。通过籽粒灌浆过程中干物质积累的测定发现突变体lg1-D的灌浆速率从花后第九天开始显著高于野生型,从花后12天开始干物质积累量显著高于野生型。2.通过开花前颖壳横向石蜡切片的观察和统计发现,突变体lg1-D颖壳在横向上细胞数目极显著增加,说明突变体lg1-D粒宽的增加主要是由细胞数目的增加引起的;扫描电镜观察发现突变体lg1-D颖壳纵向表面的细胞缩短,推测突变体lg1-D粒长的增加也是由于颖壳纵向细胞数目增加引起。3.遗传分析表明突变体lg1-D由半显性单基因控制。将突变体lg1-D与籼稻品种协青早B杂交,利用F_2定位群体将突变基因定位在第2号染色体短臂物理距离89 kb的区间内。该区间内有6个ORFs,基因组测序发现,只有ORF2(LOC_02g14730)最后一个外显子上存在一个单碱基的替换,导致蛋白翻译提前终止,产生的突变体蛋白在C端缺失了160个氨基酸残基。ORF2编码一个泛素特异性蛋白酶(OsUBP15)。转基因互补和干扰验证,OsUBP15的突变就是导致突变体表型的原因,并证明OsUBP15正向调控水稻粒宽,突变体lg1-D为功能获得型突变。4.荧光定量RT-PCR实验和转基因植株GUS组织染色实验证明,OsUBP15呈现组成型表达模式,在根、茎、叶、叶鞘、幼穗、发育中的籽粒中均有表达,在幼穗中表达量相对较高。通过对gOsUBP15-GFP转基因株系幼根GFP的观察发现,OsUBP15在细胞核和细胞质中均有分布。5.体外去泛素实验证明,OsUBP15蛋白具有去泛素功能,可以从泛素前体上将单个的泛素分子切割下来。同时由lg1-D编码的突变蛋白Osubp15也具有去泛素的功能。说明突变蛋白C-端缺失并没有失去泛素酶的功能。烟草瞬时表达发现Osubp15-GFP融合蛋白在细胞中积累量明显高于OsUBP15-GFP,推测Osubp15蛋白稳定性提高,然后通过LUC实验证明了Osubp15蛋白的稳定性高于野生型OsUBP15蛋白。突变体lg1-D表型变化是由于Osubp15蛋白稳定性提高,细胞内Osubp15蛋白积累量增加引起的。6.酵母双杂交实验和Pull-down实验证明OsUBP15能够和水稻中与拟南芥AtDA1同源的蛋白OsDA1互作,并且OsDA1可以调控OsUBP15蛋白的降解,这与拟南芥中的报道一致。突变体蛋白Osubp15也具有和OsDA1互作的能力,但在酵母双杂交实验中发现,Osubp15和OsDA1互作的能力比野生型OsUBP15蛋白弱。7.利用CRISPR/CAS9技术,在野生型的背景下敲除OsUBP15使粒宽变窄,敲除GW2使粒宽变宽,而双突变体lg1-2 gw2-4和lg1-3 gw2-3粒宽并不是典型的加性效应;在lg1-D背景下将GW2敲除,粒宽增加的幅度低于野生型背景下GW2敲出的株系,说明OsUBP15和GW2在遗传关系上并不是完全独立的。
【图文】：
图 1.1 拟南芥（左）和水稻种子概况（右）。(Li & Li, 2016）Fig 1-1 Overview of seeds in arabidopsis (left) and rice (right).粒型的遗传分析粒的形状和大小主要由外部颖壳的形状和大小决定，而开花后籽粒的灌浆响到籽粒的大小。从遗传上看，颖壳来自于二倍体的母体植株，其形状和；而占种子最大体积的胚乳是由三倍体的受精极核发育来的，胚是由受精形状和大小可能同时受到母体植株基因型和合子基因型的影响。另外，或线粒体中的遗传物质也会影响到籽粒的发育（石春海等，2003）粒型是一个复合性状，包括粒长、粒宽、长宽比、粒厚、粒重，是由多个朱军，2000）。从遗传力方面看，粒长、粒宽和长宽比的遗传力较高，在不，而粒厚的遗传力较低，容易受到环境的影响（熊振民 & 孔繁林,1982, 石, 易小平,1989）。随着分子标记技术的发展和应用，利用不同的遗传群体，，与水稻粒型相关的 QTL 位点，它们分布在水稻的所有染色体上（Huang 的控制粒长和粒宽的 QTL，主要表现为加性效应，同时也存在显性效应。性 QTL，同时存在母性效应的影响。长宽比是由粒长和粒宽构成的复合性
图 1.2 水稻籽粒相关的 QTL 在染色体上的分布（Huang et al., 2013）Figure 1.2. Distribution of quantitative trait loci (QTLs) for grain traits on rice chromosomes.红色字体表示已经克隆的控制水稻粒型和粒重的主效 QTL，绿色字体表示精细定位的 QTL 位点，蓝色线段标识初定位的 QTL 的大致位置和数目。Major QTLs associated with grain shape and weight that have been characterized by gene cloning (labeled in red) or byfine mapping (labeled in green). The locations of QTLs affecting grain shape and weight that have been identified only inprimary mapping experiments are indicated by blue bars with the corresponding number of QTLs.1.3 水稻粒型调控的分子机制随着分子标记和测序技术的发展，克隆了越来越多的控制水稻籽粒大小的基因，大致涉及以下几种调控途径：转录调控途径；Qg源激素调控途径；G 蛋白信号传导途径；泛素-蛋白酶体途径（图 1.2）。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511;Q943.2
本文编号：2672295
【图文】：
图 1.1 拟南芥（左）和水稻种子概况（右）。(Li & Li, 2016）Fig 1-1 Overview of seeds in arabidopsis (left) and rice (right).粒型的遗传分析粒的形状和大小主要由外部颖壳的形状和大小决定，而开花后籽粒的灌浆响到籽粒的大小。从遗传上看，颖壳来自于二倍体的母体植株，其形状和；而占种子最大体积的胚乳是由三倍体的受精极核发育来的，胚是由受精形状和大小可能同时受到母体植株基因型和合子基因型的影响。另外，或线粒体中的遗传物质也会影响到籽粒的发育（石春海等，2003）粒型是一个复合性状，包括粒长、粒宽、长宽比、粒厚、粒重，是由多个朱军，2000）。从遗传力方面看，粒长、粒宽和长宽比的遗传力较高，在不，而粒厚的遗传力较低，容易受到环境的影响（熊振民 & 孔繁林,1982, 石, 易小平,1989）。随着分子标记技术的发展和应用，利用不同的遗传群体，，与水稻粒型相关的 QTL 位点，它们分布在水稻的所有染色体上（Huang 的控制粒长和粒宽的 QTL，主要表现为加性效应，同时也存在显性效应。性 QTL，同时存在母性效应的影响。长宽比是由粒长和粒宽构成的复合性
图 1.2 水稻籽粒相关的 QTL 在染色体上的分布（Huang et al., 2013）Figure 1.2. Distribution of quantitative trait loci (QTLs) for grain traits on rice chromosomes.红色字体表示已经克隆的控制水稻粒型和粒重的主效 QTL，绿色字体表示精细定位的 QTL 位点，蓝色线段标识初定位的 QTL 的大致位置和数目。Major QTLs associated with grain shape and weight that have been characterized by gene cloning (labeled in red) or byfine mapping (labeled in green). The locations of QTLs affecting grain shape and weight that have been identified only inprimary mapping experiments are indicated by blue bars with the corresponding number of QTLs.1.3 水稻粒型调控的分子机制随着分子标记和测序技术的发展，克隆了越来越多的控制水稻籽粒大小的基因，大致涉及以下几种调控途径：转录调控途径；Qg源激素调控途径；G 蛋白信号传导途径；泛素-蛋白酶体途径（图 1.2）。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511;Q943.2
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1 师翠兰;水稻粒型调控基因OsUBP15的图位克隆与功能分析[D];中国农业科学院;2019年
本文编号：2672295
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