microRNA-7敲除小鼠模型的建立及雄性生殖力分析

发布时间：2020-05-23 02:24

【摘要】：microRNA-7是一种在各物种间序列高度保守的microRNA。已有研究表明,microRNA-7在疾病的发生、器官的发育、癌症的产生等生物活动中发挥着重要的作用,并且在内分泌器官中有较高水平的表达。然而,其在动物生殖发育过程中的作用及机理尚不明确。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了 microRNA-7三种亚型的基因敲除小鼠模型,并对其雄性生殖力进行了分析,为进一步研究microRNA-7在动物生殖发育过程中的作用奠定了基础。首先,利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测了成年小鼠各组织器官中microRNA-7的表达水平。结果表明microRNA-7在垂体、下丘脑、肾上腺等内分泌组织中具有高水平的表达,并在睾丸、子宫、附睾等生殖器官中具有较高水平的表达。此外,原位杂交检测结果表明,microRNA-7在小鼠睾丸中的支持细胞及各阶段生殖细胞中均有表达。其次,利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术,构建了 microRNA-7a1、microRNA-7a2以及microRNA-7b基因敲除小鼠模型。通过采用目标基因PCR扩增、测序、Real-time PCR的检测方法,对小鼠模型进行鉴定,结果表明microRNA-7三种亚型基因敲除小鼠均为基因序列大片段缺失个体,且缺失位于microRNA-7成熟序列区域。microRNA-7三种亚型基因敲除小鼠的microRNA-7基因表达水平都有极显著的降低。利用T7EI法对基因敲除小鼠潜在脱靶基因进行检测,结果表明三种microRNA-7基因敲除小鼠模型中均不存在脱靶效应。对microRNA-7三种亚型基因敲除小鼠模型的表型分析,发现基因敲除小鼠的出生率和成活率较野生型小鼠相比无明显差异。microRNA-7a2基因敲除成年小鼠的睾丸、附睾、子宫组织的体积与重量较野生型相比有显著性的减小和降低。但microRNA-7a1和microRNA-7b基因敲除成年小鼠各组织器官重量和形态与野生型小鼠相比无明显差异。配种实验结果表明,microRNA-7a2基因的缺失会导致雄性和雌性小鼠的不育,然而microRNA-7a1和microRNA-7b基因敲除小鼠与野生型小鼠相比繁殖力无显著性差异。对microRNA-7a2基因敲除成年小鼠睾丸和附睾组织进行切片染色观察,结果显示,睾丸中部分曲细精管的生精上皮中有空洞产生,附睾组织结构无明显变化,但附睾尾管腔中精子的数量明显减少。对microRNA-7a2基因敲除雄性小鼠精子活力检测发现,其精子数目、精子运动能力都较野生型小鼠相比有显著性的降低。血清中促性腺激素检测表明,雄性microRNA-7a2基因敲除小鼠血清中促卵泡激素(FSH)与黄体生成素(LH)的激素水平均有显著性的下降。最后,为进一步研究microRNA-7a2在雄性小鼠生殖系统中的作用和功能,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功的构建了 Loxp序列标记的microRNA-7a2的转基因小鼠模型(microRNA-7a2flox/flox),为microRNA-7a2条件性基因敲除小鼠模型的建立奠定了基础。本研究结果表明,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的microRNA-7三种亚型基因敲除小鼠模型具有高可靠性,可以用于microRNA-7功能及其作用机理的研究。另外,本研究结果表明microRNA-7a2的缺失会造成雄性小鼠不育,生殖系统功能的改变,说明microRNA-7a2在小鼠的生殖发育中发挥着重要的作用。
【图文】：

（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ），通过碱基互补配对的方式识别基因，并逡逑根据互补程度的不同进而指导ＲＩＳＣ降解靶ｍＲＮＡ或者阻碍靶基因ｍＲＮＡ的翻译。逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ的生物成及加工具体过程如下（图１－１）：逡逑首先，ｍｉｃｒｏＲＮＡ基因在ＲＮＡ聚合酶ＩＩ邋（ｐｏｌ邋ＩＩ）的作用下，在细胞核中转录，逡逑产生一个长链的初级转录产物，其称为ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ。其在结构上与ｍＲＮＡ类似，具逡逑有５’帽子（７ｍＧｐｐｐＧ）和３’多聚腺苷酸尾巴（５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’）结构，长度逡逑一般大于ｌｋｂ。逡逑其次，在细胞核中，ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ在三型核酸内切酶Ｄｒｏｓｈａ与双链ＲＮＡ结合蛋白逡逑ＤＧＣＲ８形成的微型处理复合体中进行切割，产生大小为７０？８０个核苷酸左右的前体逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ，称为ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ。产生的ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ序列中有部分碱基反向互补，逡逑进而形成发卡结构（Ｄｅｎｌｉｅｔａｌ．，邋２００４）。逡逑然后

１．２邋ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７邋研究概述逡逑１．２．邋１邋ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７邋的表达逡逑在两侧对称的物种中，ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７序列在进化上具有高度保守性（图１－２）和逡逑组织特异性，这表明ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７在生物的生命活动中发挥着重要的作用逡逑（Ｈｏｒｓｈａｍ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１５）。逡逑在人体中，ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７有三个来自不同基因成员的亚型，，分别为ｍｉｃｒｏＲＮＡ＿７－ｌ，逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７－２邋和邋ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７－３。ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７＿ｌ邋存在于邋９邋号染色体逦基因的逡逑内含子中；ｍｉｃｒｏＲＮＡ＿７－２存在于５号染色体的基因间；ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７－３存在于１９号逡逑染色体ＰＧＳＦｌａ的内含子中。每一种ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７基因独立转录形成独有的ｍｉｃｒｏＲＮＡ逡逑初级转录物邋ｐｒｉ－ｍｉＲ－７－１，ｐｒｉ－ｍｉＲ－７－２邋和邋ｐｒｉ－ｍｉＲ－７－３，随后形成独立的邋ｍｉｃｒｏＲＮＡ逡逑前体邋ｐｒｅ－ｍｉＲ－７－１，ｐｒｅ－ｍｉＲ－７－２邋和邋ｐｒｅ－ｍｉＲ－７－３邋（Ｈａ邋ａｎｄ邋Ｋｉｍ，邋２０１４ｂ），最后所有的逡逑前体形成相同的成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７序列。有研宄表明，ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７－１和逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７－２会受到自己宿主基因的转录因子ＨＯＸＤ１０和ｃ－Ｍｙｃ的直接调控逡逑（Ｃｈｏｕ邋ｅｔ邋ａｌ．？邋２０１０；邋Ｒｅｄｄｙ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００８）0逡逑与人基因组中ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７分布情况类型
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q492;Q78

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