自噬和能量代谢影响兔iPSCs的诱导效率

发布时间：2020-05-24 01:02

【摘要】：体细胞诱导为多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)包含众多的细胞生理状态变化,包括核质比增加、线粒体减少和自噬改变等。我们的前期研究发现,自噬与兔体细胞重编程为诱导多能干细胞(RiPSCs)的过程密切相关,但其作用机理尚不清楚。因此,本试验通过探究RiPSCs诱导过程中细胞自噬和能量代谢的相关变化;在此基础上,研究雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)促进细胞自噬对RiPSCs诱导过程的影响。为解析细胞自噬在重编程过程中的作用和丰富重编程机理奠定基础。研究结果如下:1兔iPSCs诱导过程中自噬的变化:通过四环素(Dox)诱导型慢病毒载体将OCT4、SOX2、C-MYC、KLF4(OSKM)导入兔成纤维细胞(REF)中,观察重编程过程中细胞形态变化,并对获得的RiPSCs进行免疫荧光及RT-PCR的多能性分析;;接着采用RT-PCR和透射电子显微镜的方法对重编程过程中细胞自噬的相关变化情况进行分析。结果显示,在重编程过程中,细胞变小、细胞核变大、细胞边缘折光性强、发生形态转变的细胞能够与未转变的细胞明显区别开来,并形成细胞集落。免疫荧光结果表明,RiPSCs克隆表达OCT4、SSEA4,NANOG。在重编程过程中,多能性基因C-MYC、KLF4、SOX2、OCT4的表达量呈现先升高后降低的趋势;自噬相关基因的表达量也呈现先升高后降低的趋势。透射电镜结果显示,自噬体样结构在重编程过程中也是呈现先增多后减少的趋势。以上结果说明,RiPSCs诱导过程中多能基因的表达和自噬水平均呈现先升高后降低的趋势。2兔iPSCs诱导过程的代谢变化:本试验采用Mitotracker线粒体特异性标记及RT-PCR对代谢相关基因的mRNA相对表达量进行检测;同时,使用细胞能量代谢仪(Seahorsse XF24 Extracellular Analyzer,XF)对重编程过程中的细胞进行线粒体呼吸和糖酵解功能检测,进一步细胞能量代谢表型进行分析,评估细胞所处的代谢类型。结果显示,重编程过程中线粒体形态由长杆状变成小点状,数量迅速减少。线粒体发生相关基因NRF1、PCG1αα的表达量在重编程过程中呈现先上升后下降的趋势;TFAM、Rad51的表达量在重编程过程中呈现先下降后上升的趋势。糖酵解相关基因PFK、HK2在RiPSCs中的表达量达到最高,PK在RiPSCs中表达量达到最低。XF试验结果显示,REF、诱导5d细胞、RiPSCs代谢能力逐渐增强;其中REF代谢相对较弱,偏向于静息状态;RiPSCs代谢旺盛,属于高能量需求类型的细胞,更容易发生糖酵解。以上结果说明,重编程过程中细胞线粒体形态由长杆状转变成小点状且数量迅速减少;REF代谢能力相对较弱,偏向静息状态;RiPSCs代谢旺盛,更倾向于发生糖酵解。3促进自噬对RiPSCs诱导过程的影响:在前面试验研究基础上,添加Rapa促进细胞自噬,探讨调控自噬对RiPSCs诱导效率、重编程过程中多能性相关基因、自噬相关基因的表达以及细胞代谢的影响。结果显示,添加0.5nM Rapa处理,促进自噬显著提高碱性磷酸酶阳性克隆数和多能性基因C-MYC、OCT4在RiPSCs中的表达量;重编程过程中自噬相关基因表达水平升高,细胞自噬体样结构增加。XF结果显示,Rapa抑制了重编程过程中细胞线粒体呼吸代谢、降低了糖酵解功能的细胞代谢。以上结果表明,促进自噬降低了细胞的生物能量,提高了重编程效率,但同时也减弱了细胞对外界的应激抵抗能力。以上结果表明,在RiPSCs诱导过程中,细胞自噬水平呈现先升高后降低,细胞代谢能力逐渐增强;添加雷帕霉素,促进细胞自噬水平,可以通过降低细胞的生物能量,从而提高重编程效率,但同时也减弱了细胞对外界的应激抵抗能力。
【图文】：

慢病毒,周期,体系,细胞

并换成含Ｄｏｘ的２０Ｋ诱导培养基中进行培养，每天换液一次，，同时活细胞工作逡逑站下观察细胞形态变化并拍照记录。根据细胞形变等数据得到ＲｉＰＳＣｓ诱导的周期，如逡逑图１－１所示。逡逑将加入Ｄｏｘ后的诱导培养时间计为０天，根据诱导过程中，细胞的形态记录可知，逡逑在诱导的第２天少量细胞开始发生形态变化，细胞变小；诱导的第３天形变的细胞边缘逡逑折光性强，细胞核变大，能够与未形变细胞明显区别开来；诱导第４天，细胞^u始聚集；逡逑诱导第５天形变的细胞聚成集落，第６天集落中的细胞排列紧密；诱导第８天，形成的逡逑克隆中间开始出现凋亡现象，提示可以进行传代培养。根据记录得出兔成纤维细胞诱导逡逑过程中细胞的形态变化如图１－２所示。逡逑传代并换成逡逑ＫＳＲ诱导液逡逑病毒：逡逑感个染逦ＭＥＴ过程细逦个ＲｉＰＳＣｓ－ｌｉｋｅ逦个逡逑胞逐渐形变逦克隆形成邋＞邋挑取兖隆逡逑－２ｄ逦Ｏｄ逦５ｄ逦８ｄ逦ｌ0ｄ逡逑图１－１邋ＯＳＫＭ慢病毒体系下兔ｉＰＳＣｓ的诱导周期逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ｒａｂｂｉｔ邋ｉＰＳＣｓ邋ｕｎｄｅｒ邋４Ｆ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑２３逡逑

形态变化,细胞的,细胞,形变

并换成含Ｄｏｘ的２０Ｋ诱导培养基中进行培养，每天换液一次，同时活细胞工作逡逑站下观察细胞形态变化并拍照记录。根据细胞形变等数据得到ＲｉＰＳＣｓ诱导的周期，如逡逑图１－１所示。逡逑将加入Ｄｏｘ后的诱导培养时间计为０天，根据诱导过程中，细胞的形态记录可知，逡逑在诱导的第２天少量细胞开始发生形态变化，细胞变小；诱导的第３天形变的细胞边缘逡逑折光性强，细胞核变大，能够与未形变细胞明显区别开来；诱导第４天，细胞^u始聚集；逡逑诱导第５天形变的细胞聚成集落，第６天集落中的细胞排列紧密；诱导第８天，形成的逡逑克隆中间开始出现凋亡现象，提示可以进行传代培养。根据记录得出兔成纤维细胞诱导逡逑过程中细胞的形态变化如图１－２所示。逡逑传代并换成逡逑ＫＳＲ诱导液逡逑病毒：逡逑感个染逦ＭＥＴ过程细逦个ＲｉＰＳＣｓ－ｌｉｋｅ逦个逡逑胞逐渐形变逦克隆形成邋＞邋挑取兖隆逡逑－２ｄ逦Ｏｄ逦５ｄ逦８ｄ逦ｌ0ｄ逡逑图１－１邋ＯＳＫＭ慢病毒体系下兔ｉＰＳＣｓ的诱导周期逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ｒａｂｂｉｔ邋ｉＰＳＣｓ邋ｕｎｄｅｒ邋４Ｆ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑２３逡逑
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q813

【参考文献】