电压门控性氯离子通道ClC-2促进十二指肠黏膜离子转运及碳酸氢盐分泌的作用及机制研究
发布时间：2020-06-01 22:01
【摘要】：研究背景:哺乳动物和人的十二指肠黏膜上皮具有吸收和分泌两大功能,其分泌粘液和HCO_3~-的能力,对于保护脆弱的十二指肠上皮免受胃酸和胃蛋白酶等侵袭因子的损害至关重要。目前已知囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)和Cl~-/HCO_3~-阴离子交换器(AE)是参与十二指肠黏膜上皮顶端HCO_3~-分泌主要的蛋白。但除了CFTR和AE之外,还发现肠上皮细胞表达能够介导阴离子分泌的其他几种Cl~-通道,其中ClC-2通道已经证明在肠上皮细胞的顶端或/和基底外侧膜中表达。ClC-2通道是一类电压门控性阴离子通道ClC超家族的成员,在全身广泛表达,发挥非常重要的生理作用,在肠道ClC-2通道可介导结肠Cl~-分泌,其特异性激动剂鲁比前列酮已经作为治疗便秘的药物在临床广泛应用。到目前为止,ClC-2通道在小肠上皮阴离子分泌中的作用,特别是十二指肠黏膜分泌中的作用和机制很少被研究。因此我们旨在探讨ClC-2通道介导十二指肠黏膜上皮细胞分泌的作用和分子机制,并初步探索ClC-2与Ca~(2+)信号、CFTR与cAMP信号的相互作用。研究方法:首先,应用组织免疫荧光技术和荧光实时定量RT-PCR技术检测小鼠十二指肠黏膜中ClC-2蛋白和mRNA的表达和定位情况;然后通过Ussing Chamber实验测量小鼠十二指肠黏膜离子分泌功能,分别将6-8周野生型C57小鼠及CFTR~(-/-)小鼠的十二指肠黏膜剥离肌层并安装在Ussing小室中,药物刺激后同时记录体外十二指肠短路电流(Isc)和HCO_3~-分泌;小鼠体内十二指肠黏膜HCO_3~-分泌(DMBS)通过CO_2敏感电极测量,将小鼠十二指肠下段游离结扎,采用局部灌流和全身静脉注射给药两种方式,收集十二指肠分泌液测量;采用单细胞数字Ca~(2+)测定系统检测十二指肠上皮细胞系SCBN细胞中的游离Ca~(2+)([Ca~(2+)]cyt)浓度;通过短路电流(SSC)技术检测小鼠十二指肠黏膜的跨上皮电阻(TEER)。研究结果:1.ClC-2在小鼠十二指肠黏膜有表达,并且定位于基底侧(浆膜侧);2.鲁比前列酮(lubiprostone,10-1000 nM),一种选择性ClC-2激动剂,仅在小鼠十二指肠浆膜侧给药时,浓度依赖性地引起Isc增高和HCO_3~-分泌,在黏膜侧(顶侧)给药时未检测到Isc和HCO_3~-分泌(p0.01,n=5);3.在组织外液中完全去除Cl~-后,鲁比前列酮无论在浆膜侧还是黏膜侧均不能刺激十二指肠Isc增高;但即使存在DIDS(Cl~-/HCO_3~-交换抑制剂)时,也不影响十二指肠HCO_3~-分泌(p0.05,n=6);4.甘氨酰胺(一种CFTR通道阻滞剂)能够抑制鲁比前列酮诱导的十二指肠HCO_3~-分泌(p0.01,n=6);此外,与同窝野生型小鼠相比,鲁比前列酮诱导的HCO_3~-分泌在CFTR~(-/-)小鼠中明显降低(p0.01,n=5);5.鲁比前列酮(1μM)在十二指肠腔局部灌注并未改变体内基础DMBS,但鲁比前列酮(0.1 mg/kg)腹腔注射能够诱导DMBS,并且能够被ClC-2通道阻滞剂Cd~(2+)明显抑制(p0.01,n=6);6.鲁比前列酮激活ClC-2后SCBN细胞内游离Ca~(2+)无明显变化(p0.05,n=10),抑制Ca~(2+)激活的K~+通道和抑制cAMP信号通路后鲁比前列酮介导的十二指肠Isc和HCO_3~-分泌无明显抑制(p0.05,n=6);鲁比前列酮激活ClC-2后十二指肠黏膜TEER值无明显变化(p0.05,n=6)。结论:本研究通过小鼠体内外黏膜Isc和HCO_3~-分泌检测,发现鲁比前列酮可选择性激活十二指肠上皮浆膜侧ClC-2通道,在十二指肠黏膜的离子分泌中发挥重要作用。1.小鼠体内外十二指肠浆膜侧ClC-2通道激活后,能够介导黏膜Cl~-及HCO_3~-分泌;2.ClC-2激活后对细胞内Ca~(2+)信号、细胞间紧密连接及cAMP信号通路无明显影响;3.ClC-2介导十二指肠黏膜Cl~-及HCO_3~-分泌需要黏膜侧CFTR参与,可能机制是浆膜侧ClC-2通道激活为CFTR提供了HCO_3~-。因此,本研究为十二指肠上皮细胞中ClC-2通道的功能性表达及其在DMBS调节中的新作用提供了证据,为ClC-2在十二指肠溃疡及黏膜保护中的深入研究提供了基础。
【图文】：
图 1-2.免疫荧光检测 ClC-2 在小鼠十二指肠黏膜的表达2.3 讨 论文献报道上皮细胞系中 ClC-2 表达在上皮细胞的顶侧，然而，人、小鼠、豚鼠和大鼠肠道都很清楚的观察到 ClC-2 定位在结肠黏膜的基底外侧。目前 ClC-2 在细胞和膜的定位存在争议，认为 ClC-2 的定位可能取决于物种、组织以及用于定位的方法和使用的ClC-2 抗体[22]。ClC-2 可位于基底外侧膜、顶膜、紧密连接区或肠上皮细胞胞质中[36-40]例如，使用抗 ClC-2 抗体 ACL-002，pAB-218，H-90 和 YY9 通常显示 ClC-2 定位在几个组织的侧膜，而其他抗体如 ClC21-A、鸡抗-ClC-2 和兔抗-ClC-2 显示 ClC-2 定位在顶膜和紧密连接处。而相同的抗体显示 ClC-2 的分布是物种依赖的。例如，ClC-002 抗体显示 ClC-2 定位在小鼠结肠中的基底侧，，而分布在人体结肠的细胞质中。而 ClC-2 在小鼠十二指肠黏膜的表达与定位已有文献报道，Pena-Munzenmayer 采用免疫荧光技术比较 ClC-2 在小鼠十二指肠与结肠黏膜的定位，发现 ClC-2 表达在小鼠结肠黏膜顶侧，而
表二 鲁比前列酮刺激小鼠十二指肠黏膜 HCO3-分泌No Titrant used: 0.5 mM HCl date: 06/12/17Stimulant: RU-0211 comments:Ring Area: 0.1 cm2 Patient namCe: 57 Surg timevolt clamp: mV SEX: M Mount time.No: Time PD Isc pH HCl titr Isc net HCl G (condt) Isc R HCO3 Comments(min) (mV) (mA) (ml) (mA/cm2) (ml) (msiem/cm2) (mEq/cm2-h)(W·cm2) (mmol/cm2 -h)0 1.2 3.06 7.087 0 38.25 0.00 25.50 1.78 31.37 0.00 EP1 5 1.2 3.13 7.084 0.027 39.13 27.00 26.08 1.82 30.67 2.032 10 1.1 2.98 7.091 0.045 37.25 18.00 27.09 1.74 29.53 1.353 15 1 2.95 7.081 0.07 36.88 25.00 29.50 1.72 27.12 1.884 20 1.1 2.99 7.089 0.1 37.38 30.00 27.18 1.74 29.43 2.255 25 1 2.88 7.092 0.121 36.00 21.00 28.80 1.68 27.78 1.586 30 0.9 2.53 7.09 0.152 31.63 31.00 28.11 1.47 28.46 2.33 RU 10-47 35 2.5 7.36 7.083 0.179 92.00 27.00 29.44 4.29 27.17 2.03 100nM8 40 2.6 8.09 7.084 0.211 101.13 32.00 31.12 4.71 25.71 2.409 45 2.3 7.14 7.085 0.248 89.25 37.00 31.04 4.16 25.77 2.7810 50 2.4 7.56 7.089 0.282 94.50 34.00 31.50 4.41 25.40 2.5511 55 2.2 7.08 7.088 0.316 88.50 34.00 32.18 4.13 24.86 2.5512 60 2.3 7.5 7.092 0.351 93.75 35.00 32.61 4.37 24.53 2.6313 65 2 6.83 7.081 0.392 85.38 41.00 34.15 3.98 23.43 3.0814 70 1.8 6.3 7.084 0.43 78.75 38.00 35.00 3.67 22.86 2.8515 75 1.7 5.97 7.092 0.463 74.63 33.00 35.12 3.48 22.78 2.4816 80 3.6 5.98 7.087 0.509 74.75 46.00 16.61 3.49 48.16 3.4517 85 1.7 6.03 7.081 0.552 75.38 43.00 35.47 3.51 22.55 3.2318 90 1.7 6.31 7.088 0.
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R333
【图文】：
图 1-2.免疫荧光检测 ClC-2 在小鼠十二指肠黏膜的表达2.3 讨 论文献报道上皮细胞系中 ClC-2 表达在上皮细胞的顶侧，然而，人、小鼠、豚鼠和大鼠肠道都很清楚的观察到 ClC-2 定位在结肠黏膜的基底外侧。目前 ClC-2 在细胞和膜的定位存在争议，认为 ClC-2 的定位可能取决于物种、组织以及用于定位的方法和使用的ClC-2 抗体[22]。ClC-2 可位于基底外侧膜、顶膜、紧密连接区或肠上皮细胞胞质中[36-40]例如，使用抗 ClC-2 抗体 ACL-002，pAB-218，H-90 和 YY9 通常显示 ClC-2 定位在几个组织的侧膜，而其他抗体如 ClC21-A、鸡抗-ClC-2 和兔抗-ClC-2 显示 ClC-2 定位在顶膜和紧密连接处。而相同的抗体显示 ClC-2 的分布是物种依赖的。例如，ClC-002 抗体显示 ClC-2 定位在小鼠结肠中的基底侧，，而分布在人体结肠的细胞质中。而 ClC-2 在小鼠十二指肠黏膜的表达与定位已有文献报道，Pena-Munzenmayer 采用免疫荧光技术比较 ClC-2 在小鼠十二指肠与结肠黏膜的定位，发现 ClC-2 表达在小鼠结肠黏膜顶侧，而
表二 鲁比前列酮刺激小鼠十二指肠黏膜 HCO3-分泌No Titrant used: 0.5 mM HCl date: 06/12/17Stimulant: RU-0211 comments:Ring Area: 0.1 cm2 Patient namCe: 57 Surg timevolt clamp: mV SEX: M Mount time.No: Time PD Isc pH HCl titr Isc net HCl G (condt) Isc R HCO3 Comments(min) (mV) (mA) (ml) (mA/cm2) (ml) (msiem/cm2) (mEq/cm2-h)(W·cm2) (mmol/cm2 -h)0 1.2 3.06 7.087 0 38.25 0.00 25.50 1.78 31.37 0.00 EP1 5 1.2 3.13 7.084 0.027 39.13 27.00 26.08 1.82 30.67 2.032 10 1.1 2.98 7.091 0.045 37.25 18.00 27.09 1.74 29.53 1.353 15 1 2.95 7.081 0.07 36.88 25.00 29.50 1.72 27.12 1.884 20 1.1 2.99 7.089 0.1 37.38 30.00 27.18 1.74 29.43 2.255 25 1 2.88 7.092 0.121 36.00 21.00 28.80 1.68 27.78 1.586 30 0.9 2.53 7.09 0.152 31.63 31.00 28.11 1.47 28.46 2.33 RU 10-47 35 2.5 7.36 7.083 0.179 92.00 27.00 29.44 4.29 27.17 2.03 100nM8 40 2.6 8.09 7.084 0.211 101.13 32.00 31.12 4.71 25.71 2.409 45 2.3 7.14 7.085 0.248 89.25 37.00 31.04 4.16 25.77 2.7810 50 2.4 7.56 7.089 0.282 94.50 34.00 31.50 4.41 25.40 2.5511 55 2.2 7.08 7.088 0.316 88.50 34.00 32.18 4.13 24.86 2.5512 60 2.3 7.5 7.092 0.351 93.75 35.00 32.61 4.37 24.53 2.6313 65 2 6.83 7.081 0.392 85.38 41.00 34.15 3.98 23.43 3.0814 70 1.8 6.3 7.084 0.43 78.75 38.00 35.00 3.67 22.86 2.8515 75 1.7 5.97 7.092 0.463 74.63 33.00 35.12 3.48 22.78 2.4816 80 3.6 5.98 7.087 0.509 74.75 46.00 16.61 3.49 48.16 3.4517 85 1.7 6.03 7.081 0.552 75.38 43.00 35.47 3.51 22.55 3.2318 90 1.7 6.31 7.088 0.
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R333
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2 张佳琪;王凤云;谢t熞
本文编号：2692130
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