表达CTLA-4抗体的重组流感病毒构建及溶瘤效果的研究

发布时间：2020-06-04 08:26

【摘要】：第一部分 表达CTLA-4抗体的重组流感病毒构建及筛选背景:原发性肝癌(HCC)是全世界范围内的恶性肿瘤之一,世界范围内死亡率居第三位,而在亚洲其死亡率居第二位。尽管科学家们不断探索研究治疗肿瘤的方法,但由于肿瘤细胞增长迅速,易侵袭周围组织等,就目前为止其治愈率并未显著的提高。因此,寻找新的治疗肝癌的方法一直是人类面临的挑战。越来越多的研究表明,溶瘤病毒可选择性地靶向性癌细胞而对正常细胞无明显影响,细胞毒性T淋巴细胞相关抗-4(CTLA-4)可靶向T细胞中的调节途径,增强抗肿瘤免疫应答,因此,研究表达CTLA-4抗体的溶瘤病毒对癌症治疗方面有重要作用。目的:拯救表达免疫检查点muCTLA-4抗体的重组流感病毒,并对其进行全面鉴定。方法:(1)在A/Puerto Rico/8/34(PR8)流感病毒的PB1上构建muCTLA-4的抗体重链、PA上构建muCTLA-4的抗体轻链,与流感病毒PR8的6个质粒pHW191-PB2、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M、pHW198-NS共转染COS-1、MDCK细胞,收集细胞上清,将其接种于SPF鸡胚、超滤浓缩、纯化等步骤获得重组溶瘤流感病毒,命名为rFlu-muCTLA-4;(2)通过电镜观察重组溶瘤流感病毒rFlu-muCTLA-4的形态与大小分布、血凝试验、EID_(50)、PCR等方法对rFlu-muCTLA-4进行全面鉴定;(3)重组溶瘤流感病毒rFlu-muCTLA-4经纯化、浓缩、离子交换后,利用ELISA实验测定rFlu-muCTLA-4中anti-CTLA-4抗体的含量。结果:(1)经透射电镜观察rFlu-muCTLA-4多数为球形,表面有棘突,其颗粒直径约在80~120nm之间,表明重组溶瘤流感病毒rFlu-muCTLA-4的病毒形态和颗粒大小分布符合流感病毒典型特征;(2)收取阳性尿囊液,经血凝检测为阳性,rFlu-muCTLA-4的血凝效价为2~(9~10);rFlu-muCTLA-4的EID_(50)为10~(-8) EID_(50)/mL、重组溶瘤病毒rFlu-muCTLA-4的PB1、PA基因片段与预期大小一致。(3)分别收取接种重组病毒rFlu-muCTLA-4第2、3、4天的鸡胚,经蛋白纯化,可检测到anti-CTLA-4抗体。结论:本实验成功构建了一株表达免疫检查点抑制剂muCTLA-4抗体的重组流感病毒,并完成对该病毒的初步鉴定,为下一步的体内、外实验提供一定的基础依据。第二部分 表达CTLA-4抗体的重组流感病毒治疗H22肝癌细胞的体内、外实验研究目的:评价构建的重组溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4对小鼠H22肝癌的治疗效果。方法:(1)体外实验,采用MTS方法检测溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4对H22细胞株的杀伤作用,并检测r Flu-mu CTLA-4对H22细胞的毒性;(2)体内实验:通过建立Balb/c小鼠肝癌H22细胞皮下种植模型,观察并评价溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4对肿瘤的抑制和延长生存情况。(3)小鼠治疗后,眼球取血,收集血清,通过血凝抑制实验(HI)检测小鼠产生的保护性抗体情况。结果:MTS检测结果显示,1.0 MOI的重组病毒P=0.0307(P0.05)、2.0 MOI的重组病毒P=0.0017(P0.01),5.0 MOI的重组病毒P=0.0011(P0.01),2.0 MOI、5.0 MOI的病毒相比1.0 MOI组H22细胞活力显著降低,呈现剂量依赖性,表明r Flu-mu CTLA-4能特异性杀伤H22细胞(P0.05)。在小鼠模型中能显著抑制肿瘤体积,并延长小鼠的生存期。在血凝抑制实验检测到了较高的血凝抑制抗体效价,实验结果表明重组溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4可以诱导小鼠产生保护性的抗体。结论:重组溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4在体内、外能靶向杀伤肝癌细胞,并能够抑制小鼠肿瘤体积的增长,延长小鼠的生存期,并且给予病毒治疗后小鼠的体内可以产生较高的保护性抗体,此研究有望为溶瘤病毒靶向治疗肝癌提供新的思路。
【图文】：

学硕士研究生学位论文（2019） 释放到细胞或血液循环中的一类物质，病原体相关的分子模式是病原体上两者均被模式识别受体识别引起免疫应答。溶瘤病毒又可促进树突细胞浸瘤免疫应答的肿瘤相关抗原（tumor-associatedantigen，TAA）的交叉呈递统性的抗肿瘤免疫反应[9]（Fig. 1）。大多数可用的溶瘤病毒均为经过基靶向性较强，，并降低非肿瘤性宿主细胞的毒力[10]。因此，它们可以通过增别和随后的免疫激活来刺激促炎环境，从而抵消恶性细胞的免疫逃避。还可利用肿瘤的致耐受性机制，促进病毒感染和杀死不受免疫系统保护的

点抑制剂毒疗法虽然在治疗肿瘤中潜力巨大，但其作为单一疗法实现肿瘤的治因此，现在正在努力寻找可以进一步增强溶瘤病毒抗肿瘤功效的合理之一是通过免疫检查点疗法支持溶瘤病毒介导免疫原性细胞死亡。查点是指在免疫系统中存在的一些抑制性信号通路，细胞毒 T淋巴细otoxic T lymphocyte-associated antigen 4, CTLA-4）是 T淋巴细胞激活激因子。CTLA4 与抗原递程细胞上的 B7结合，降低白介素-2及其受胞的细胞周期停滞于 Gl 期等，进而抑制 T淋巴细胞的增殖[34,7]。程序programmed death protein-1, PD-1）为Ⅰ型跨膜糖蛋白，是免疫球蛋中的一员，是另一重要的免疫抑制受体，但是 PD-1的功能与 CTL，PD-1 主要调节组织和肿瘤内的效应 T 细胞活性，而不是在 T 细胞用[35]。免疫检查点抑制剂 anti-CTLA-4 和 anti-PD-1 能够释放参与维细胞因子，而活化的 T 细胞可以破坏肿瘤细胞（Fig. 2）。
【学位授予单位】：内蒙古医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R735.7;Q78

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 ;此次甲型H1N1流感病毒的特点[J];科技档案;2009年02期

2 ;甲型H1N1流感的传播途径是什么[J];科技档案;2009年02期

3 樊旭成;韩志国;薛娜;相然;高枫;;2015～2018年乌鲁木齐市B型流感病毒流行特征分析[J];医学信息;2019年06期

4 焦鹏涛;范文辉;孙业平;刘文军;李晶;;B型流感病毒研究进展[J];生物工程学报;2018年06期

5 张瑶;舒跃龙;王大燕;;B型流感病毒相关研究进展[J];疾病监测;2017年02期

6 万永虎;庄丽;郑勤妮;任丽娟;付琳;蒋维佳;张德著;唐光鹏;李世军;;贵州省2013—2016年B型流感病毒流行特征分析[J];中国感染控制杂志;2017年04期

7 Wang C;Yu H;Horby PW;何高丽;张菁;;比较感染流感病毒H7N9、H5N1和2009年H1N1大流行的住院患者[J];中国感染与化疗杂志;2015年03期

8 ;认识流感病毒 探索生命奥秘[J];科学大观园;2019年06期

9 张艳春;;你了解流感病毒吗[J];初中生学习指导;2019年35期

10 王承民;;流感高发 关于流感病毒你应该知道的N个真相[J];科学大观园;2018年03期

相关会议论文 前10条

1 宋豪;;D型流感病毒的入侵机制研究[A];中国生物工程学会第二届青年科技论坛暨首届青年工作委员会学术年会摘要集[C];2017年

2 宋豪;;D型流感病毒的入侵机制研究[A];中国生物工程学会第二届青年科技论坛暨首届青年工作委员会学术年会论文集[C];2017年

3 ;流感病毒全球动荡的预警信号[A];科学媒介中心2015年推送文章合集（上）[C];2016年

4 杜雄伟;李叶;杨卓;;A型流感病毒对小鼠致病机制的研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（上册）[C];2009年

5 伍锐;段正赢;刘泽文;杨克礼;梁望旺;邓均华;周丹娜;田永祥;;A型流感病毒为载体的开发及其应用[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年

6 高玉伟;夏咸柱;扈荣良;王立刚;刘丹;邹啸环;黄耕;贺文琦;;虎流感病毒的分离、鉴定、基因分析与抗体调查(摘要)[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（下）[C];2003年

7 李叶;廖明;辛朝安;;A型流感病毒对小鼠致病机制的研究进展[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年

8 李康生;;流感病毒分子进化研究进展[A];2016新发传染病研究热点研讨会论文集[C];2016年

9 高福;;流感病毒侵入与多肽抑制药物[A];第二届传染病诊治高峰论坛暨2009年浙江省感染病、肝病学术年会论文汇编[C];2009年

10 徐敏;向华;;流感病毒核酸诊断方法的研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年

相关重要报纸文章 前10条

1 李洁尉　卢圣贤 朱丹萍;新复制型流感病毒可完整保留其基因组[N];科学时报;2011年

2 本报记者 丁佳;流感病毒研究再下一城[N];科学时报;2011年

3 记者 王静 实习生 马越;最新研究：流感病毒有望得到遏制[N];中国科学报;2018年

4 本报记者 张佳星;为流感病毒传播画出“航班网络”图[N];科技日报;2018年

5 本报记者 贡晓丽;认识流感病毒 探索生命奥秘[N];中国科学报;2019年

6 本报记者 吴佳佳;流感病毒未变异 药品供应仍充足[N];经济日报;2018年

7 重庆商报-上游财经记者 陈竹;有望快速找到流感病毒的对抗分子[N];重庆商报;2018年

8 本报驻欧盟记者 张兴慧;世界卫生组织：甲型H1N1流感病毒可能继续扩散[N];中国青年报;2009年

9 方舟子;猪被冤枉了吗？[N];中国青年报;2009年

10 本报记者 张伟;非理性比流感病毒更可怕[N];中国青年报;2009年

相关博士学位论文 前10条

1 徐颖;H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的跨种传播机制研究[D];中国科学技术大学;2019年

2 刘静;A型流感病毒通用VLPs疫苗的研究与通用抗体的评价[D];北京协和医学院;2019年

3 杨雯昱;HPAIV H7N9/AAca减毒活疫苗在哺乳动物模型上的免疫保护力评价及其与细菌的协同致死作用研究[D];甘肃农业大学;2019年

4 刘瑞寒;全基因分析揭示H3N2流感病毒临床分离株的低血凝滴度与NS基因截短相关[D];北京协和医学院;2018年

5 钱伟;A型流感病毒NS1蛋白效应结构域介导的天然免疫逃避机制研究[D];华中农业大学;2017年

6 王祥;流感病毒低剂量重复感染免疫机制和H7N9禽流感疫苗研究[D];苏州大学;2017年

7 谢英;复制缺陷型H1N1甲型流感病毒的构建与生物学特性分析[D];北京协和医学院;2018年

8 吴香蔚;干扰素刺激基因TRIM14和ASB13抗A型流感病毒复制的机制研究[D];北京协和医学院;2018年

9 陈雪媛;人miR-302a调控IRF5基因表达在流感病毒感染机制中的研究[D];武汉大学;2018年

10 任超超;A型流感病毒重排分子机制及对病毒生物学特性影响[D];中国农业科学院;2019年

相关硕士学位论文 前10条

1 李科成;基于复杂网络的流感病毒传播模型研究[D];石家庄铁道大学;2019年

2 余晓颖;H3N2犬流感病毒M1蛋白胞内抗体的制备及活性研究[D];吉林农业大学;2019年

3 方树珊;奥司他韦对多种亚型流感病毒的抑制作用及其耐药株中药单体的筛选研究[D];安徽中医药大学;2019年

4 董锁花;表达CTLA-4抗体的重组流感病毒构建及溶瘤效果的研究[D];内蒙古医科大学;2019年

5 李浩;H1N1流感病毒导致小鼠胚胎心脏肥大表型及基因筛选[D];湖南师范大学;2017年

6 王娟;甲型H1N1、H3N2流感病毒在MDCK细胞系上的增殖特性研究[D];西北民族大学;2019年

7 刘美辰;NS1与NOLC1相互作用对流感病毒（H1N1）复制的影响[D];辽宁大学;2019年

8 徐姿;我国甲型H3N2流感病毒HA/NA基因的分子特征及Th22细胞在H3N2感染患者中的临床意义[D];江苏大学;2018年

9 夏青;D型流感病毒反向遗传系统的构建及其HE基因免疫原性的研究[D];长春理工大学;2019年

10 陈浩峰;儿童流感流行病学调查及流感病毒快速检测的临床应用[D];湖南师范大学;2017年

本文编号：2696117