EZH2的一种新型异构体在生物体内的分布和功能研究

发布时间：2020-06-11 21:59

【摘要】：可变剪接指同一基因在转录后,不同外显子的剪接形式使得同一基因的表达产物有着不同的剪接异构体,常对应着不同的功能。EZH2作为表观调控元件PRC2复合体的重要组成部分,参与细胞生命活动的调节。EZH2的剪接异构体在细胞内有着多种形式,一种被人们忽视的剪接异构体形式EZH2-X9在SD生物体内有着广泛表达,具体功能尚不明确。目的:1.分离鉴定出EZH2-X9型剪接异构体,对核酸序列、氨基酸序列进行比对分析;2.探究EZH2-X9型剪接异构体在细胞和SD大鼠中的表达分布以及随着个体发育过程中不同组织中表达量的变化;3.初步探究EZH2-X9型剪接异构体在细胞中与普通的全长EZH2相比功能上所具有的异同点。方法:1.在PC12细胞和SD大鼠中,通过PCR技术和基因测序寻找EZH2-X9剪接异构体的核酸表达,结合MUSCLE和BLAST对核酸及氨基酸序列进行分析;2.通过非放射性原位杂交技术(FISH)、免疫细胞化学技术(IF)、实时定量基因扩增荧光检测(q-PCR)以及蛋白质印记(WB)研究EZH2-X9剪接异构体在细胞内的表达以及分布;在SD大鼠中,通过特异性引物的设计和使用,q-PCR对不同组织中的mRNA表达分布进行研究,并利用WB检测蛋白表达的同步性。3.在未分化的PC12细胞中,结合基因工程的手段,通过荧光显微镜观察分析并统计细胞的变化,探究EZH2-X9剪接异构体对NGF诱导的细胞分化过程中所起到的具体功能影响。4.在PC12细胞内,通过降解同源序列靶基因mRNA的基因敲低(KD)方式,分别阻止普通EZH2-WT和EZH2-X9剪接异构体的表达,结合WB和蛋白质免疫共沉淀(IP)探究EZH2-WT和EZH2-X9剪接异构体在细胞内的功能差异性。结果:1.EZH2-X9在SD大鼠体内广泛分布,在细胞水平上EZH2-X9剪接异构体主要分布于细胞核内。2.在SD大鼠体内,EZH2-WT和EZH2-X9在不同组织中的表达量有着一定的差异性,脑中表达量和肺、心、肝相比较高;二者在同一组织中随着个体发育时间的增长而衰减,且蛋白表达量同步。3.在PC12细胞中分别过表达和KD二者后,在mRNA水平上发现二者有着相互影响;EZH2-X9对于组蛋白H3第27位赖氨酸的甲基化作用没有显著的影响,IP实验发现EZH2-X9能和EZH2-WT竞争结合EED,组成PRC2复合体;4.EZH2-WT和EZH2-X9对与细胞分化都有着重要的功能,在NGF诱导下未分化PC12细胞分化过程中,在KD-EZH2-X9时细胞的突起生长总长度、突起生长平均长度、突起生长数目、NOI%相比KD-EZH2-WT都有着更为显著的降低;KD-EZH2-X9会提高UIR1、MapLC3和GSK的表达。结论:1.EZH2-X9主要存在于SD大鼠的脑中,呈发育期差异表达;2.EZH2-X9和和EZH2-WT竞争结合EED,组成PRC2复合体却不能介导H3K27me3;3.EZH2-X9和EZH2-WT通过调控不同的靶基因和分子途径调节细胞生长。
【图文】：

第二章 EZH2-WT 和异构体 EZH2-X9 序列对比 实验结果.1 EZH2 在生物体内的各种剪接形式在中央神经系统的发展过程中，EZH2 起到了不可替代的重要作用。测序和对不同序列的比对分析，，目前已经在 SD 大鼠中被研究发现的剪接体有八种，分别被命名为 EZH2-WT、EZH2-X1 X8，对应的各2.1 所示。从结构上分析可以得知不同的外显子的间接可以获得不同的则有可能被翻译形成具有不同一级结构的蛋白质。但是在中央神经发现的 EZH2 蛋白只有 EZH2-WT 序列对应结构的，这表明其它的结可能是一种错误的剪接形式。

10图 2.2 EZH2-WT、X9 序列比对Figure 2.2 Sequence alignment of EZH2-WT and X9关于 EZH2-WT 的蛋白质一级结构分析，V3 区域位于 EZH2-WT 蛋白的 CXC区域。这一区域的氨基酸组成上是一种富含 cystein 的区域，大量的半胱氨酸缺失表明 EZH2-X9 相对于 EZH2-WT 而言可能会缺乏 CXC 区域对应的相关功能。EZH2-WT 蛋白的各区域相关功能如图所示，Exon-V3 的位置如图 2.2（a） 所示。关于 EZH2-WT 的氨基酸序列和 EZH2-X9 的可能氨基酸序列进行比对的结果，如图 2.2（b）所示，其中 Exon-V3 片段的氨基酸序列见方框中所示。以 SD 大鼠全脑提取的总 RNA 反转录产物作为模板进行 PCR 扩增，随后的琼脂糖凝胶电泳进一步发现有两条明亮的条带，如图 2.3（a）。从 Marker 的分子量进行初步判断，与 DNA 带的位置与 EZH 2-WT 和 EZH2-X9 的预期大小非常吻合，说明 EZH 2-WT 和 X9 是在大鼠脑内表达的真正的 EZH 2 转录本。
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

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本文编号：2708523