赤红球菌定量蛋白质组学及其二鸟苷酸环化酶的融合表达和催化特性研究

发布时间：2020-06-12 20:31

【摘要】：红球菌作为一类耐有机溶剂的极端微生物,在生物转化和生物修复等领域具有潜在作用。挖掘赤红球菌SD3菌株有机溶剂响应相关蛋白并进行功能表征,有利于加深对微生物有机溶剂耐受性机制的理解,也能促进微生物在有机相催化反应中的应用。本研究的主要内容和结果如下:1)通过iTRAQ标记技术和液相色谱-串联质谱方法分析了赤红球菌SD3菌株在甲苯和苯酚胁迫下响应情况。与对照组相比,分别鉴定出362和488个差异蛋白。同时挖掘了赤红球菌SD3菌株的有机溶剂耐受性相关的应激蛋白、膜蛋白、调控系统和代谢途径。此外,应用qPCR在转录水平上证明甲苯或苯酚胁迫下,赤红球菌SD3菌株的CspA家族应激蛋白、4-硝基苯酚2-单加氧酶和二鸟苷酸环化酶的表达水平发生了上调。2)通过克隆赤红球菌SD3的二鸟苷酸环化酶基因dgc,利用生物信息学手段对二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)的理化性质和结构特征进行分析,初步判断DGC蛋白是含6段跨膜区的疏水性蛋白,含有50%以上的稳定α螺旋结构,具有典型的GGDEF催化活性结构域。进化树分析表明赤红球菌SD3和食醚红球菌的DGC亲缘关系较近,推测赤红球菌SD3的DGC也属于Class III nucleotidyl cyclases家族,具有类似的分子功能。通过I-TASSER建模工具得到了DGC蛋白的三级结构,利用分子对接技术模拟了底物GTP与DGC蛋白通过疏水作用和氢键产生相互作用,从而形成稳定结合的构象。3)为了进一步研究赤红球菌SD3有机溶剂响应相关蛋白二鸟苷酸环化酶的功能和合成c-di-GMP的活力。对赤红球菌SD3中的dgc基因进行密码子优化,构建了重组表达质粒pPGH-Dgcs,并转入E.coli BL21(DE3)进行异源表达。通过优化表达条件,在16℃和0.1 mM IPTG诱导条件下,融合GST标签以帮助DGC膜蛋白的正确折叠和异源表达。经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化得到一个新的全长GST-DGC融合蛋白,并由LC-MS/MS分析确定为目的蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定GST-DGC蛋白的大小为71.9 kDa,与理论值73.0 kDa大致相符。Blue Native PAGE结果表明GST-DGC融合蛋白形成了八聚体。GST-DGC酶的最适反应pH值和最适反应温度分别为8.0和47°C,并且表现出高热稳定性,在87℃孵育1 h后,依然保留了94%的活性。此外,GST-DGC融合蛋白也表现出pH稳定性。该酶催化GTP底物生成c-di-GMP的反应动力学分析表明,其Km、Vmax和Kcat值分别为9.8μM、0.7μM/min和1.3 S~(-1)。一些金属离子如Zn~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(2+)、Ni~(2+)和Co~(2+)对GST-DGC蛋白质有抑制作用,而金属离子Mg~(2+)、K~+和Na~+和螯合剂EDTA则对GST-DGC蛋白质有激活作用。更重要的是,该融合蛋白在甲苯、环己烷和正己烷存在下也显示出相当高的稳定性。进一步应用分子对接方法预测了GST-DGC蛋白可能的金属离子和有机溶剂激活或抑制位点,为酶分子的定点改造以提高c-di-GMP产量提供靶点。总之,本研究通过蛋白质组学和荧光定量PCR初步证明了二鸟苷酸环化酶与微生物有机耐受性的关系。首次异源表达得到红球菌中含有6段跨膜区的完整二鸟苷酸环化酶,与已报道的海栖热袍菌嗜热二鸟苷酸环化酶的Kcat值2.6 min~(-1)相比,本研究纯化得到GST-DGC融合蛋白催化合成c-di-GMP效率提高了约30倍。本研究为大规模催化合成c-di-GMP提供了可能,为揭示二鸟苷酸环化酶与微生物有机耐受性的关联机制奠定基础。
【学位授予单位】：江西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q93

【参考文献】