RAD6B基因缺失对小鼠生长发育及雌性生殖的影响研究

发布时间：2020-06-13 21:03

【摘要】：目的:E_2泛素交联酶RAD6在多种细胞过程中发挥重要作用,包括组蛋白泛素化修饰、DNA损伤修复和精子形成等;在哺乳动物中,RAD6相关基因RAD6A与RAD6B,编码蛋白高度同源。在本文中我们以RAD6B~(-/-)小鼠为实验动物模型,对RAD6B基因缺失对小鼠生长发育及雌性生殖的影响进行深入研究。方法:1)、通过同窝RAD6B~(+/-)小鼠杂交获得RAD6B~(-/-)小鼠,子代回交亲本提高RAD6B~(-/-)小鼠比例,同窝野生型作为对照;2)、从出生起监测小鼠体重变化及雌性生殖相关指标;3)、取小鼠垂体做冰冻切片并进行HE染色,对比RAD6B~(+/+)与RAD6B~(-/-)小鼠垂体体积及质量之间是差异;4)、分离小鼠外周血清,通过ELISA方法测定与生长及生殖相关激素的分泌量;5)、提取垂体组织RNA,通过RT—PCR测定垂体五种特异性细胞的mRNA表达量;6)、对RAD6B~(+/+)与RAD6B~(-/-)小鼠进行计算机断层扫描(CT),探究骨骼线性生长发育差异;7)、分离和培养垂体原代细胞,CCK8测定细胞的生长曲线和激素分泌量;并用500uM H_2O_2诱导垂体原代细胞衰老、然后CCK8测定诱导后细胞生长趋势及激素分泌量;8)、垂体组织冰冻切片β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色检测垂体细胞中β-Gal表达量;9)、免疫荧光(IF)染色观察生长激素(GH)细胞分布密度及P16阳性细胞数量;10)、Western Blot测定GH(生长激素)、P21、PRLR(泌乳素受体)蛋白表达水平。结果:RAD6B基因敲除小鼠出生时体重与野生型相比差异不明显,但从1周龄开始体重差异逐渐增大,3-4周龄体重差异最明显(P0.01);然而从7周龄起体重差异逐渐减小直至消失(约10周龄)。垂体对生长发育、新陈代谢、生殖等有重要影响,因此我们取小鼠垂体进行组织学和形态学的差异探究,垂体称重及HE结果显示:RAD6B~(-/-)小鼠垂体组织质量轻,垂体总体积小并且神经垂体和垂体中叶体积与WT相比差异不明显,说明垂体体积差异主要出现在垂体前叶;除此之外,垂体GH(生长激素)mRNA表达量下调(P0.01);且GH(生长激素)免疫荧光染色(IF)结果表明垂体促生长激素细胞数量显著减少(P0.001),GH(生长激素)外周血分泌量也明显下降(P0.05)。肝源性的IGF-1(胰岛素样因子-1)是GH(生长激素)的下游蛋白,GH对体细胞生长的影响是通过其直接作用和IGF-1的间接作用来实现;RT-PCR结果显示:3周龄小鼠垂体生长激素(GH)及肝脏IGF-1 mRNA表达量下降均约50%(GH,P0.01,IGF-1,P0.05);GH(生长激素)是GH(生长激素)/IGF-1(胰岛素样因子)轴的关键组成因子,GH/IGF-1轴对生长发育与生殖起关键调控作用。CT结果表明:1)、RAD6B~(-/-)小鼠骨骼纵轴长度(门齿至骶骨尾端)在4周龄时显著短于RAD6B~(+/+)(P0.01),10周龄时差异消失,而24周龄(6月龄)差异再次出现(P0.01)。2)、4周龄时RAD6B~(-/-)小鼠的股骨与胫骨长度同样短于RAD6B~(+/+)小鼠(P0.01),10周龄小鼠股骨和胫骨的长度差异逐渐减少趋于相等。3)、24周龄小鼠的股骨及胫骨没有明显差异;除此之外,我们还发现4周龄RAD6B~(-/-)小鼠的卵巢子宫、睾丸及乳腺发育不良;而垂体泌乳素(PRL)及其受体(PRLR)对乳腺发育、刺激和维持泌乳有至关重要的影响,因此我们测定垂体泌乳素(PRL)mRNA的表达量,结果显示:泌乳素(PRL)mRNA的表达量略微增加(P0.05),然后我们提取乳腺组织蛋白及RNA,用WB及PT-PCR测定泌乳素受体(Prlr)蛋白及mRNA表达量,结果显示RAD6B~(-/-)小鼠的垂体泌乳素受体蛋白及mRNA的表达量均下降(P0.01);且RAD6B~(-/-)雌性小鼠的第一次动情期推迟、生殖间隔周期延长、产仔量及母性行为下降。分离垂体原代细胞培养并用ROS(H_2O_2)诱导细胞衰老;我们发现:未进行任何处理的RAD6B~(-/-)垂体原代细胞的细胞增殖能力弱于RAD6B~(+/+)(P0.05),加入500 uM H_2O_2诱导衰老后测定细胞增殖能力,结果表明:2小时时RAD6B~(-/-)垂体原代细胞的增殖能力略增加(P0.05),但4小时时增殖能力显著下降(P0.05),此趋势持续至增殖停止;加入500 uM H_2O_2后RAD6B~(+/+)与RAD6B~(-/-)垂体原代细胞的GH(生长激素)的分泌量均下降,但RAD6B~(-/-)细胞的下降程度更明显(P0.01)。接下来我们对6月龄小鼠垂体组织进行P16荧光染色与β-Gal,并提取垂体蛋白测定P21的蛋白表达量;结果显示:RAD6B KO小鼠的垂体β-Gal阳性细胞数量明显多于WT(P0.001),P16的阳性细胞数量同样多于WT(P0.01);而P21的蛋白表达量KO少于WT(P0.01)。结论:1)、RAD6B~(-/-)小鼠体重下降、垂体前叶体积减小与垂体前叶原代细胞增殖能力下降;并且垂体前叶促生长激素细胞数量减少,GH(生长激素)分泌量下降;以上结果表明:RAD6B基因缺失引起小鼠垂体发育不全,功能下降。2)、GH(生长激素)蛋白及肝脏IGF-1(胰岛素样因子1)mRNA表达量下降,引起GH/IGF-1轴功能缺陷,导致生长发育迟缓,生殖器官发育不全与青春期延迟(性成熟延迟)3)、乳腺泌乳素受体(PRLR)蛋白及mRNA表达量下降,导致乳腺发育不成熟。4)、加入ROS(H_2O_2)诱导剂后,垂体前叶垂体原代细胞增殖能力显著下降并且GH(生长激素)分泌量明显下降;表明RAD6B基因缺陷导致垂体前叶细胞增殖能力下降、并导致垂体促生长激素细胞功能下降5)、RAD6B~(-/-)小鼠的垂体组织中β-Gal和P16阳性细胞数量增加,提示RAD6B基因缺失导致垂体细胞衰老。
【图文】：

图 1：RAD6B 敲除鼠垂体功能低下。图 A：分别取出生后 21 天的 RAD6 基因缺失小鼠和野生型小鼠拍照对比身形差异；图 B： RAD6B KO 和 WT 小鼠的体重（*P<0.05,**P<0.01）；图 C：解剖 RAD6B-/-小鼠（雌雄各 3-5 只）和 RAD6B+/+小鼠（雌雄各 3-5 只）取脏器进行称重

促生长激素细胞的数量仅约 RAD6B+/+的 30%（P<0.05），并且荧光强度弱于 RAD6B+/+小鼠（图2A）；随后，我们用蛋白免疫印迹（WB）和 ELISA 的方法测定 GH 在垂体的蛋白表达量与 GH 在外周血的分泌量，结果显示：RAD6B-/-小鼠垂体生长激素蛋白的表达量显著低于 RAD6B+/+小鼠（图 1C,D P<0.001）；且外周血生长激素的分泌量下降，约为 RAD6B+/+小鼠的 65%（图 1E，P<0.001）。紧接着我们测定了 GH 依赖性肝脏源 IGF-1 的 mRNA 表达水平，，因为 GH 分泌的脉冲性质，其随机循环水平而不能准确地反映 GH 的效率。统计结果发现：与 RAD6B+/+小鼠相比，RAD6B-/-肝脏 IGF-1 mRNA 的表达量降低约 50％（图 1F P<0.05）。由以上表明：RAD6B 基因缺失导致垂体促生长激素细胞数量下降
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q344

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本文编号：2711742