功能化四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备及用于Hakai质粒DNA的分离纯化以及负载

发布时间：2020-06-15 00:42

【摘要】：磁性纳米颗粒(Magnetic nanoparticles,MNPs)作为一类新型功能材料,因其众多的优良性能被广泛应用于生物医学等领域。本文主要研究功能化的四氧化三铁MNPs在核酸分离纯化以及基因递送两方面的应用,具体内容分为三部分:(1)Hakai蛋白作为肺癌治疗新靶标的探索性研究。我们首次发现Hakai蛋白在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞系中高表达,且利用siRNA技术敲低Hakai的表达能显著抑制NSCLC细胞的增殖、迁移以及侵袭,提示Hakai蛋白在NSCLC发生以及发展中起到重要作用,可作为一个潜在的治疗新靶点。这部分结果为我们后续的功能化四氧化三铁磁性纳米材料对Hakai质粒DNA的分离纯化以及负载研究奠定了基础。(2)合成乙二胺修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒(EDASHT-MNPs)并深入研究其在核酸分离纯化中的应用。我们首先对经典的共沉淀法合成步骤加以修改并获得MNPs,进一步对该材料进行酒石酸氢钠包裹以及乙二胺修饰,获得EDA-SHT-MNPs,利用透射电子显微镜(TEM)、动态光散射仪(DLS)、X-射线光电子能谱分析(XPS)等对MNPs的微观形貌以及EDA-SHTMNPs的表面电位、表面修饰等进行表征。随后,我们一方面系统探究了EDASHT-MNPs对细菌的Hakai质粒DNA的提取情况以及提取产物的生物活性;另一方面,为了验证EDA-SHT-MNPs提取DNA是否具有广谱性,我们进一步检测其对哺乳动物细胞基因组DNA的提取效果。结果表明,本课题合成的EDASHT-MNPs能高效提取质粒DNA以及基因组DNA且不影响DNA的生物活性;此外,与商品化试剂盒相比,EDA-SHT-MNPs在DNA提取总量和纯度方面均具有优势,体现出较好的应用价值。(3)新型磁性纳米材料用于基因转染或基因治疗的初步研究。如上所述,在第一部分研究工作中,我们发现Hakai蛋白可作为一个潜在NSCLC治疗靶标。且在第二部分工作中,我们已证明表面功能化的磁性纳米材料具有较好的DNA结合能力。在这部分工作中,利用聚酰胺-胺树枝状大分子(Polyamidoamine dendrimer,PAMAM)具有良好的生物相容性特点,结合在第二部分中所获得的磁性纳米材料,重新设计并合成出一种新型磁性纳米材料,以Hakai基因为研究对象,探索该材料在基因转染或基因治疗中的应用。我们先以乙二胺为核心、丙烯酸甲酯为原料,通过迈克尔加成反应以及迭代法合成了三代聚酰胺-胺树枝状大分子(generation-3 polyamidoamine dendrimer,G3),然后利用G3直接包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒或者修饰酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒,得到两种表面修饰阳离子聚合物的磁性纳米颗粒,分别命名为G3-MNPs以及G3-SHT-MNPs。通过TEM、DLS等方法,我们表征了该材料的微观形貌、表面电位以及尺寸大小。进而,利用体外核酸结合和细胞毒性实验,我们分别检测了两种材料与Hakai质粒DNA的结合情况以及对细胞的毒性作用。初步的研究结果显示,与G3-MNPs相比,G3-SHT-MNPs与质粒的体外结合效果较好,且毒性更低,体现出较好的生物相容性。以上结果表明,G3-SHT-MNPs可作为潜在的基因转染以及治疗载体,未来进一步的开发,有望用于基于Hakai或其它靶标的基因治疗研究。综上所述,本文首次证明Hakai蛋白可作为一个潜在的NSCLC治疗新靶标,以Hakai基因为研究对象,本文成功合成了EDA-SHT-MNPs以及G3-SHT-MNPs,并证明前者能高效的提取细菌中Hakai质粒DNA以及细胞基因组DNA,可用于后续的核酸提取应用研究等;后者体现出潜在的基因转染以及治疗功能,具有重要的应用前景。
【学位授予单位】：安徽工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q523;TB383.1
【图文】：

示意图,涂覆,共轭物,腺病毒

图 1.1 不同生物共轭物的示意图：（A）单克隆抗体绑定到 MNPs，（B）适体涂覆的 MNPs，（C）用大约 10nm 的 MNPs 涂覆的腺病毒（D）用 pH 或热敏性聚合物涂覆的 MNPs，其载有疏水性药物1.1.2 MNPs 的合成方法目前，已经开发出许多合适的方法用于合成各种不同功能的 MNPs，这些制备方法有多种分类方式，按学科领域主要可分为物理和化学法两大类别。物理法主要有喷射法、机械球磨法、粉末冶金法、氢化研磨法等。化学法是目前使用最多的方法，主要有还原法、蒸发冷凝法、热分解法、共沉淀法、氧化沉淀等。1.1.3 MNPs 的优良性能首先，MNPs 具有大约 1-100 纳米范围内的可控尺寸，其尺寸小于或等于某些生物医学系统，如细胞（10-100 微米）、病毒（20-450 纳米）、蛋白质（5-50 纳米）和基因（2 纳米宽，10-100 纳米长）[14]。其次，超顺磁性使得材料可以被外部磁场操纵并驱动到特定的区域和目标生物实体。因此，MNPs 可以应用于生物标记、生物传感、生物分子分离、药物和基因传递。第三，MNPs 由于其单畴性质，在外加交流磁场作用下，其磁矩可承受布朗或 Ne'el 波动的定向热波动，导

核酸分离,核酸,氨基,磁性材料

所需时间长；并且使用的试剂耗材价格贵，对人体有一定的毒害性。最主要的是提取过程中会掺杂一些杂质，使得提取的 DNA 纯度不高。因此，基于这些局性的考虑，新型高效的分离纯化 DNA 的方法有待被开发。其中，利用 MNPs 备简单、在外磁场下易于分离等特点，有望成为一类有潜力的核酸分离纯化的体。（3）MNPs 在核酸分离纯化中的优势本课题在利用 EDA-SHT-MNPs 进行核酸分离纯化方面时，主要基于三个面的考虑：其一，表面经氨基功能化修饰的 MNPs 表面带有大量的正电荷，在冲体系适当的条件下，通过正负电荷的相互作用，带有大量负电荷的核酸可以磁性材料表面的氨基结合。其二，利用 MNPs 本身特有的磁性以及纳米量级的寸，外部施加较小的磁力即可将 MNPs 和核酸的复合物从结合缓冲体系中吸回收，从而避免进一步费时费力的分离程序[33]。其三，MNPs 与 DNA 的结合式有很多（如图 1.2），在本课题中，核酸与氨基 MNPs 凭借静电相互作用结合用适宜 PH 以及盐离子浓度的洗脱液甚至是去离子水即可将 DNA 从磁性材料面洗脱下来，得到较纯的核酸样品。

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