基于链交换扩增SEA新方法对金黄色葡萄球菌快速检测方法的研究

发布时间：2020-06-16 21:25

【摘要】：金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌,由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒事件频繁发生。发展一种对金黄色葡萄球菌的快速检测方法具有重要的意义,目前对金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括传统培养法、免疫学检测法、分子生物学检测法,这些方法都存在不可避免的缺点,传统培养法检测周期长,操作繁琐;免疫学检测法检测灵敏度低;分子生物学检测法操作过程比较复杂,不利于现场快速检测,因此建立一种简单、快速的对食源性致病菌金黄色葡萄球菌的检测方法是必不可少的。本文构建了一种新的链交换扩增(Strand Exchange Amplification,SEA)检测方法,该方法采用变性气泡介导的链交换原理,在等温条件下1小时内完成扩增反应,结合比色法,仅需要一台金属浴就可以完成对金黄色葡萄球菌的检测,结果判定肉眼可视化,检测过程简单、快速。本文用SEA法对金黄色葡萄球菌进行了可行性研究,实现了对金黄色葡萄球菌检测方法的建立。为了进一步实现SEA检测方法对实际样品的检测能力,用SEA法对金黄色葡萄球菌进行了灵敏性、特异性、抗干扰性研究,检测限低至1.0×10~-1414 M。SEA检测方法分别检测了总核酸(DNA和RNA)、DNA和RNA,实验结果表明SEA检测方法实现了无需额外的反转录可以一步法检测金黄色葡萄球菌RNA,并且检测RNA的效率高于检测DNA的效率。检测结果判别可以荧光判读,也可以通过反应体系颜色的转变,肉眼比色判读检测结果,结果操作简单便捷,不依赖于专业人员、昂贵仪器,检测结果准确。SEA方法的建立主要是为了对实际样品的检测,因此,本论文又对人工加标的猪肉样品进行检测,结果表明,SEA法最低可以检测到浓度为2 cfu/g污染的人工加标猪肉制品,满足对金黄色葡萄球菌检测标准的要求,然后又进一步对市场上抽样的112份肉制样品牛肉、猪肉、鸡肉、鱼干和火腿肠进行检测,结果表明用SEA法与传统的培养方法对比研究,SEA检测阳性率与传统培养法一致。说明SEA检测实际样品中的金黄色葡萄球菌方法可靠,有实际应用价值。本文构建了全新的RNA一步法等温扩增技术平台,整个检测过程具备简单、快速、无设备、可视化的特点,SEA检测方法也可集成到微流控芯片中,实现样本在单个设备中应答诊断,为食品中的其他致病菌提供一个即时检测平台。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.3
【图文】：

青岛大学硕士学位论文于食品中致病菌金黄色葡萄球菌的检测是按照GB4789.10-201。传统的培养方法通常包括形态学和培养法鉴定，首先根据样菌处理，按照国标要求进行富集培养，在金黄色葡萄球菌达到行生化鉴定，包括染色镜检、血浆凝固酶实验和肠毒素检验，天左右，检测结果一般只能定性不能定量[12]。传统培养法具有的复杂检测设备，成本较低的优势，但检测过程比较繁琐，需检测时间长，容易造成货物积压，造成较大的经济损失。

图 1.2 LAMP 原理图[39]Figure 1.2 Scheme of LAMP一种等温核酸扩增方法，主要可以分为线性 RCA、指检测方法被广泛应用于全基因组 DNA 分析、DNA 芯反应原理见图 1.3，在 DNA 多聚酶的作用下，DNAP 的作用下，通过环状模板进行延伸，形成指数式扩其他核酸扩增检测方法相容性好，可以很好的应用于列的分析有重要的作用[41]。但 RCA 扩增技术也存在离子的强度、核酸链结构及杂交的温度都会制约核酸非特异性扩增会产生较强的背景信号干扰，容易造

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本文编号：2716605