扬子鳄β防御素基因家族的解析及其肠道微生物冬眠适应性宏基因组学研究

发布时间：2020-06-18 21:18

【摘要】：扬子鳄(Chinese alligator,Alligator sinensis),中国特有的濒危爬行动物,国家一级保护动物,是世界现存的23种鳄类中的一员。作为一种半水生的食肉动物,扬子鳄无时无刻不经受来着环境和肠道病源微生物的潜在威胁。鳄类血清中存在具有广谱抗菌活性的抗菌肽类物质,其中β防御素(β-defensin)即是抗菌肽的一种,其构成动物先天性免疫系统的第一道屏障。不同于在哺乳动物和鸟类中对β防御素的广泛研究,关于爬行动物β防御素的信息则相对有限,在鳄目中甚至还未曾有β防御素的报道。扬子鳄还是一种具有冬眠习性的变温爬行动物。由于寒季环境温度的下降和食物的减少,扬子鳄在冬眠期间保持深度休眠、低代谢率和禁食的生理状态。基于之前16S rRNA扩增子测序的研究表明,冬眠动物的肠道微生物群落组成和结构会随着宿主生理状态和食物摄入量的变化而呈现季节性波动。但从宏基因组水平对冬眠动物肠道微生物组在功能上的季节性变化的研究却鲜有耳闻;此外,冬眠宿主肠道黏膜及其免疫屏障与肠道菌群之间的季节性互作机理也尚不明确。因此,扬子鳄是我们研究冬眠引起的肠道菌群结构、功能改变和肠道免疫应答的天然理想模型。本研究中,我们通过生物信息学手段和RACE-PCR的方法在扬子鳄基因组scaffold687_1上鉴定到一个长390 kb的β防御素基因簇,由20个新的鳄类β防御素基因(AsBDs,Alligator sinensisβ-defensin genes)组成。通过对扬子鳄β防御素的基因结构、氨基酸序列、系统进化以及组织表达的解析,揭示了扬子鳄旁系AsBDs与哺乳动物α防御素在基因演化和功能上具有高度的相似性,为后续进行的β防御素与肠道微生物的关联研究奠定了基础。针对扬子鳄肠道微生物的研究,我们通过对冬眠期和活跃期的扬子鳄消化道各段(胃、小肠和结肠)内容物和粪便样品进行16S rRNA V3-V4高变区扩增子测序,并对粪便样品进行宏基因组de novo测序,以揭示其肠道微生物在优势菌群组成、菌群结构、群落多样性和预测功能上的季节性变化规律;并探讨了扬子鳄AsBDs在肠道组织中的季节性表达模式与肠道菌群的关系。主要的研究结果如下:(1)扬子鳄β防御素基因簇包含6个鸟类同源的直系AsBDs和9个爬行动物特有的旁系同源AsBDs。旁系AsBDs拥有一段较长的(36~60个氨基酸)连接肽段(Pro-piece),与哺乳动物α防御素的长连接肽段序列特征极为相似。由于二者拥有长度相当的氨基酸序列,致使旁系AsBDs和哺乳动物α防御素在电荷数和疏水性等理化性质上也保持高度的相似性。(2)旁系和直系AsBDs的“信号肽-连接肽”区段所受选择压力无明显差异(旁系:ω=0.759;直系:ω=0.604,p=0.471),二者ω值均小于1,经受纯化选择。旁系AsBDs成熟肽的ω值则显著高于直系AsBDs成熟肽(旁系:ω=1.208;直系:ω=0.499;p=0.034),表明旁系AsBDs成熟肽经历了更强烈的正选择压力;与哺乳动物α防御素成熟肽的进化方向一致。进化树结果显示旁系AsBDs与哺乳动物α防御素聚为一枝,暗示α防御素在进化上可能起源于爬行动物旁系AsBDs。(3)扬子鳄β防御素基因在各器官组织中的表达具有普遍性和差异性的特征。总体上,各AsBDs在消化道、脾、肝和肾等部位的表达量较高,在肌肉、胆囊和心脏中表达水平相对较低。旁系AsBDs在肠道各段的表达水平显著高于直系AsBDs在肠道相同部位的表达量,与同样在肠道中具有高表达特点的α防御素相似,暗示二者在表达和功能上也具有一定的相似性。(4)通过16S rRNA扩增子测序我们在扬子鳄肠道中鉴定到41个细菌门类和3215个OTUs。其中,变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和硬壁菌门(Firmicutes)为扬子鳄肠道微生物门水平的四大优势菌门,共同占比超过80%。基于宏基因组de novo测序,我们在扬子鳄粪便样本中共鉴定到51个细菌门和3907个细菌种,优势菌群在门和属水平上的分布情况与16S rRNA扩增子测序结果一致。(5)通过对不同季节的所有24个肠道微生物样本进行主成分分析(PCoA)、聚类分析(UPGMA)、相似性检验(ANOSIM)和典型相关性分析(CCA),结果均显示冬眠期和活跃期的扬子鳄肠道菌群在组成和结构上存在明显季节差异。环境温度和冬眠禁食是塑造扬子鳄肠道微生物群落的两个主要环境驱动因子。此外,考虑到活跃期扬子鳄的粪便与结肠处微生物群落在组成和结构上具有的较高相似度,我们提出在对濒危动物的肠道微生物进行研究时,建议使用粪便样本替代结肠样品的非损伤性取样策略。(6)拟杆门菌(Bacteroidetes)及其分类下的拟杆菌属(Bacteroides)是冬眠期扬子鳄肠道中显著大量富集的冬眠特异微生物群落,占比分别达到57.95%和55.82%。该门类的微生物具有强大的降解利用宿主来源底物——粘蛋白糖苷(Mucin glycan)的能力。基于CAZy数据库注释结果,我们总共在扬子鳄肠道宏基因组中鉴定到193个碳水化合物酶家族(CAZymes families)和458个碳水化合物酶(CAZymes)。其中有14个涉及降解和结合粘蛋白糖苷的碳水化合物酶家族和28种粘蛋白寡糖降解酶(Mucin oligosaccharide-degrading enzymes)在冬眠期显著富集,且其相对丰度显著高于活跃期。我们在细菌和宏基因组水平揭示了冬眠期肠道特异性微生物通过降解利用宿主来源的粘蛋白糖苷维持生命,以适应宿主冬眠禁食期间肠道内食物匮乏的分子机制。(7)活跃期扬子鳄消化道后段聚集着高丰度的梭杆菌门(Fusobacteria)微生物(20.37%~41.22%),具有典型的食肉动物肠道微生物群落特征。梭杆菌门(Fusobacteria)分类下贡献了95%占比的是一种具有蛋白水解功能的细菌——Cetobacterium somerae,该菌在活跃期消化道后段大量富集,其相对丰度显著高于冬眠期(活跃期vs.冬眠期:小肠:17.81%vs.0.09%,p=0.05;结肠:31.40%vs.0.35%,p=0.002;粪便:33.91%vs.0.81%,p=0.038)。除了高丰度的C.somerae,我们还检测到其它20种同样具有水解蛋白质、多肽和发酵氨基酸能力的细菌在活跃期扬子鳄肠道内显著富集,表明活跃期正常进食的扬子鳄肠道内大量聚集的蛋白质降解微生物以适应宿主高蛋白的饮食结构,对动物源性食物的细菌性降解和发酵有利于宿主对营养物质更高效地消化利用。(8)扬子鳄肠道内病源微生物分布和免疫相关基因季节性表达的相关性研究结果显示,扬子鳄肠道中检测到机会病原菌在不同季节均有分布,但活跃期肠道中存在更多的常见致病菌和病毒序列(活跃期vs.冬眠期:4.03%vs.0.04%)。三个旁系β防御素(AsBD105α,105θ和105α)和MHC I1327基因在冬眠期肠道组织中的显著性高表达可能是应对冬眠期细菌性粘蛋白降解导致黏膜屏障减弱的免疫补偿机制;直系β防御素(AsBD5,AsBD10和AsBD13)、MHC beta和TLR-2基因的表达量则在活跃期显著地高于冬眠期,以抵御活跃期肠道内更多的病源微生物的入侵。得益于肠道免疫基因与肠道菌群的季节性互作反馈机制,扬子鳄得以维持肠道微生态系统的稳态并保障机体的健康。综上所述,扬子鳄β防御素基因簇的解析为后续研究其它动物类群尤其是爬行动物β防御素的进化研究提供了基础信息;为理解我国特有珍稀动物扬子鳄的免疫适应机制提供了重要参考;对未来开发新的抗生素类药物提供了重要的理论和应用依据。同时,在濒危动物的系统性保护工程中,我们呼吁相关从业人员应更多地关注动物肠道微生物多样性保护。扬子鳄肠道微生物组的研究结果在濒危动物保护生物学研究以及“宿主-微生物”共生体在能量代谢和免疫应答方面的互作机理具有重要实用意义和理论价值。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q953
【图文】：

浙江大学博士学位论文 （第一部分）第一章 文献综述的分布区域逐渐缩小，仅在长江中下游部分地区尚有分布（Thorbjarnarson, 1999）中美专家在1981年组成联合调查组调查研究发现，野生扬子鳄的数量仅有300～500 条，分布区域仅在长江中游一带（北纬 30.6～31.6 度，东经 118～119.6 度狭小的范围内）（渡部摩娜等, 1982）。在 1998～2003 年间，丁由中等人（2004）对可能有野生扬子鳄生存的苏、浙、皖三省的 45 个地点进行走访调查。结果显示，野生扬子鳄个体总数大约在 120 条左右，主要分布在安徽扬子鳄国家级自然保护区内。

结构形势（C-X4-8-C-X3-5-C-X9-13-C-X4-7-C-C），其 6 个半胱氨酸通过三个二硫键，以 C1-C5，C2-C4 和 C3-C6 的半胱氨酸配对形式连接（图 1.2）（Hazlett, et al., 2014;Jarczak, et al., 2013）。在酸性环境下，二硫键能够抵抗蛋白水解作用来帮助防御素维持结构稳定，成熟的 β 防御素由三个 β 链反向平行折叠排列构成 β 折叠。β折叠使蛋白具有疏水性，以此来维持分子的功能稳定，也是 β 防御素在不同环境下能维持其抗菌活性的重要结构基础（Shafee, et al., 2016）。β 防御素的抗菌活性由其蛋白质电势和疏水性决定（Klüver, et al., 2006）。β 防御素的表面电势分布赋予了它能够渗透进微生物细胞膜的能力。表面膜电势的分布决定了 β 防御素的功能特异性，不同 β 防御素表面膜电势的分布差异决定了每个防御素蛋白具有独特的抗菌能力（Tu, et al., 2015）。防御素之间的另一个明显差异是蛋白结构环形大小和方位的不同，细微的尺寸和方位的改变都能导致折叠结构和蛋白构成的差异（Soares, et al., 2004）。β 防御素拥有的差异化的表面电势和不同的蛋白结构使其具有特异性的抗菌效力和多样化的功能活性（Tu, et al., 2015）。

本文编号：2719846