载铅超细炭黑对CAT、SOD及小鼠肝细胞毒性效应与机理的研究

发布时间：2020-06-20 12:44

【摘要】：近年来,雾霾污染越来越严重,作为雾霾主要组成部分的超细颗粒物(UFPs)对健康的影响也引起了社会的广泛关注。UFPs分布广泛,能通过呼吸道与人体接触并进入细胞,与功能蛋白结合影响其结构和功能表达,进而诱发急性肺炎、心脑血管损伤和免疫系统损伤等疾病。UFPs的组成复杂,其毒性效应是各组分共同作用的结果,目前缺乏对UFPs各组分毒性效应机理的探讨与研究。超细炭黑(UFCB)与UFPs具有相似的理化性质,可作为UFPs生物学研究的替代模型。重金属铅极易被UFPs吸附,负载了铅的UFPs在大气中广泛存在,给人类健康带来了新的问题。目前UFPs的毒理学研究主要集中在单一 UFCB颗粒对呼吸系统细胞的影响,对于多组分的UFPs作用于功能蛋白和组织器官,从而使机体致病的机理研究仍然匮乏。氧化应激是所有疾病的诱因,肝脏肩负着机体氧化防御的重要任务;过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)在保护机体免受氧化应激损伤中起着重要作用。因此本文选取小鼠原代肝细胞为靶细胞,选取CAT和SOD为靶蛋白,选取UFCB作为UFPs的生物替代模型,在细胞水平和分子水平研究比对了UFCB和载铅UFCB诱发机体氧化应激的效应与机理。本文主要包括以下几部分内容:(1)综述了大气颗粒物、UFPs、UFCB和铅的污染现状及现阶段毒理学研究进展,明确了现阶段对载铅UFPs毒性机理评价的不足,确定了本次的研究目的和研究内容。(2)利用多种方法对UFCB进行改性修饰,改性后超细炭黑(MCB)水溶液的Zeta电位为-39.7 mV,远高于改性之前的-18.2 mV,证明MCB的分散稳定性优于改性之前。将MCB应用于铅的吸附实验,最后得到铅含量为0.235 g/g的载铅MCB(即Pb-MCB)。(3)研究比对了 MCB和Pb-MCB诱发小鼠肝细胞氧化应激效应的影响。实验结果表明:肝细胞活力与MCB和Pb-MCB暴露浓度之间均呈负活力-剂量关系。细胞内MDA含量随MCB和Pb-MCB暴露浓度的增加而升高,且在50 mg/L时达到最高,分别为对照组的204.44%和172.49%,高浓度的MDA打破了细胞内部的氧化还原平衡并破坏了细胞膜的完整性,使细胞发生脂质过氧化作用从而导致细胞活力降低甚至死亡。随着MCB和Pb-MCB暴露浓度的升高,细胞内CAT的相对活力均呈先上升后下降的趋势。MCB的暴露同样导致了胞内SOD的相对活性先上升后下降,但是随Pb-MCB暴露浓度的增加,SOD的相对活性逐步上升。比对同等暴露条件下MCB和Pb-MCB对小鼠肝细胞氧化应激指标的影响发现,MCB的细胞毒性较Pb-MCB的细胞毒性强,原因是MCB较Pb-MCB带更多的负电荷,更易与膜蛋白、CAT和SOD结合作用,影响细胞和酶的活力及功能表达。(4)利用多种光谱学手段研究比对了MCB和Pb-MCB的暴露对CAT和SOD分子结构和功能的影响。结果发现:无论是MCB还是Pb-MCB都会与CAT和SOD结合,在炭黑颗粒表面形成一层“蛋白冠”类的物质,改变了CAT和SOD发色团的微环境,使蛋白质骨架结构紧缩,疏水性增强。MCB和Pb-MCB暴露染毒均使CAT的活性先上升后下降,使SOD的活性持续下降。CAT和SOD活性的变化一方面说明了结构的改变影响了酶的功能表达;另一方面酶与MCB或Pb-MCB的结合会影响其活性位点附近氨基酸的微环境,从而间接对酶的活性产生影响或者抑制作用。比对同等暴露条件下MCB和Pb-MCB对CAT和SOD分子的影响时发现,MCB对CAT和SOD结构和功能的影响大于Pb-MCB对两种酶蛋白的影响,原因是MCB带大量的负电荷,更易与带正电荷的CAT或者SOD结合作用,改变酶蛋白的结构使其活性降低;而Pb-MCB溶液中微量Pb2+的存在促进了 Pb-MCB粒子的团聚沉降,粒径的增大使Pb-MCB与酶蛋白之间的作用力和结合面积减小,因此MCB较Pb-MCB表现出更强的分子毒性。本论文从细胞和分子两个层面研究并比对了MCB和Pb-MCB对机体氧化应激机制的毒性作用机理,为多组分大气颗粒物的毒性效应评价提供了理论和方法的参考。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X171.5
【图文】：

空白图,组织切片,空白,滴注

钱孝琳等人在对大鼠支气管进行ＵＦＣＢ滴注染毒三天后发现，大鼠出现了急逡逑性肺炎症状和氧化应激效应，对肺部组织进行切片观察发现，和正常大鼠相比（图逡逑１－１Ａ）染毒大鼠的支气ｆｆ邋Ｃ图１－１邋Ｂ）有明品病变，染毒组细胞皱缩明显，血管逡逑充血严重Ｐ］。李园园等人在研宄吸入ＵＦＣＢ染毒对小鼠呼吸系统的影响时发现，逡逑吸入ＵＦＣＢ小鼠的肝脏组织的颜色加深且小鼠表现出明显的肺炎症状％。Ｔｉｎ－Ｔｉｎ逡逑等人在研宄ＵＦＣＢ对小鼠的影响时，对８周大的雄性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠鼻内滴注ＵＦＣＢ逡逑染毒，每周染毒一次，共持续４周＝最后收集检测小鼠大脑嗅球和海马体细胞炎逡逑性因子和趋化因子ｍＲＮＡ的表达情况＝实验结果显示，被１４邋ｎｍ的ＵＦＣＢ滴注逡逑染毒的小鼠嗅球中发现了细胞炎性因子的ｍＲＮＡ，这项研究首次证明了鼻内滴逡逑注ＵＦＣＢ染毒会引发小鼠大脑特定区域细胞炎性因子和趋化因子ｍＲＮＡ的表达，逡逑证明了邋ＵＦＣＢ会对大脑的免疫功能造成影响｜３（久Ｏｎｏｄａ等人在怀孕小鼠妊娠期逡逑的第５天和第９天对其进行鼻内ＵＦＣＢ滴注染毒，在幼鼠出生后的第６周和第逡逑１２周收集幼鼠的脑细胞并检测中枢神经系统血管周围的巨噬细胞（ＰＶＭｓ）的变逡逑化

粒度分布,超细炭,中位粒径

３．１改性超细炭黑的粒度分布研究逡逑利用ＢＴ－９３００Ｈ粒度检测仪测量ＳＢ１００和各类改性超细炭黑在水中形成的团逡逑聚体的粒径大小，来表征其在水溶液中分散性的差异。如图２－１所示，超细炭黑逡逑ＳＢ１００，ＭＣＢ，ＭＣＢ－Ｓ，邋ＭＣＢ－Ｃ１，邋ＭＣＢ－Ｎｃｌ邋和邋ＭＣＢ－Ｃ邋在水中形成团聚体的中逡逑位粒径分别为邋０．６３３ｎｍ，０．５１３ｎｍ，０．６３ｎｍ，０．５７３ｒｔｍ，邋０．５７３ｎｍ邋和邋０．６１ｎｍ，由此逡逑可知硝酸改性的超细炭黑ＭＣＢ在水中的分散程度最好。逡逑０．８邋ｐ逡逑°＊６３３逦０．６３逡逑．丁逦－Ｔ－逦０．５７３邋０＊５７３逦Ｕ，ｔ）１逡逑０．６邋－逦—Ｉ—逦—Ｉ—逡逑１邋ｎ邋＿邋＿逡逑ｓ邋■邋■逡逑Ｉ逦■邋■逡逑■邋■Ｉ逡逑０，ｌｕＪ，邋１１，１邋■邋■邋■逡逑图２－１改性超细炭黑的中位粒径大小逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｍｅｄｉａｎ邋ｄｉａｍｅｔｅｒ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｍｏｄｉｆｉｅｄ邋ＵＦＣＢｓ邋ｉｎ邋ｗａｔｅｒ逡逑３．２改性超细炭黑的水溶性实验分析逡逑取０．００１邋ｇ的ＳＢ邋１００和ＭＣＢ分别溶于１０邋ｍＬ的ＰＢ缓冲液中，样品分别标逡逑记为１和２，两个样品各自的水溶性如图２－２Ａ所示，１号瓶中的ＳＢ邋１００样品全逡逑部沉在容器底部，溶解度小；２号瓶中的ＭＣＢ基本全部溶解，在ＰＢ缓

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