雷公藤甲素生物合成萜类合酶及CYP450基因克隆及功能研究

发布时间：2020-06-20 17:14

【摘要】：雷公藤甲素(triptolide)被公认为雷公藤(Tripterygium wilordii Hook.f.)中主要活性成分之一,研究表明雷公藤甲素具有明显的抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等重要生物活性,并对治疗中枢神经系统疾病(如帕金森、老年痴呆症等)展现出潜在的药用价值;雷公藤甲素已成为下一个“blockbuster”药物的先导化合物之一,且多个雷公藤甲素衍生物已进入临床研究阶段。目前活性成分雷公藤甲素主要来源于:(1)化学合成,(2)从雷公藤植株中提取分离;因其结构复杂含多个手性中心,化学合成工艺繁琐,雷公藤甲素产率较低,且其在雷公藤植株中含量极低,植株生长缓慢,雷公藤甲素得率也较低:以上两种获取方式难以满足大量的商业需求,特别是雷公藤甲素及其衍生物成药后的产业化需求;因此,亟需发展新的策略与技术来获取雷公藤甲素等天然活性产物。近年来,随着合成生物学技术在紫杉醇、青蒿素和丹参酮等研究及生.产中的成功应用,表明利用合成生物学技术设计和改造微生物菌株来生产天然活性产物已经成为一种极具潜力的获取新方法。中药活性成分则是中药资源的药效物质基础,其形成是植物次生代谢途径中特有功能基因群共同调控的产物;因此本研究的目的在于:通过发掘调控雷公藤甲素生物合成的关键功能基因群,解析其生物合成途径,进而利用合成生物学技术设计和改造微生物菌株来高效生产雷公藤甲素及其衍生物。本课题组前期利用组织培养技术建立了稳定可控的雷公藤悬浮细胞培养体系,并已完成雷公藤悬浮细胞转录组深度测序分析,解析了雷公藤甲素上游生物合成途径,克隆鉴定了4个二萜合酶(TwCPS1、TwCPS2、TwCPS3、TwKS),证实 TwCPS1 催化 GGPP形成(+)-CPP,TwCPS2无生物活性,TwCPS3催化GGPP形成ent-CPP,TwKS催化ent-CPP形成16α-hydroxy-ent-kaurane和ent-kaurene;然而雷公藤甲素的二萜烯中间体结构还未确定,且催化(+)-CPP形成松香烷型二萜烯中间体的关键酶基因也未鉴定。因此,本研究在推动雷公藤甲素生物合成途径的解析进程中亟待解决两个难点:(1)明确雷公藤甲素二萜烯中间体结构,(2)明确催化雷公藤甲素二萜烯中间体形成的关键酶基因。为此本研究采用UPLC/Q-TOFMS表征了雷公藤悬浮细胞及培养基、植株不同组织部位之间的代谢物差异,并利用GC-MS在雷公藤悬浮细胞中检测到松香烷型二萜烯miltiradiene,通过底物饲喂实验证实miltiradiene为雷公藤甲素二萜烯中间体化合物:基于此,进一步筛选到萜类合酶基因TwMS,其编码蛋白催化(+)-CPP形成miltiradiene,成功揭示了雷公藤甲素从线性GGPP环化成松香烷型二萜烯中间体miltiradiene的生物过程。为进一步解析雷公藤甲素生物合成途径中CYP450参与的下游修饰过程,首先克隆并表征了雷公藤中4条NADPH-细胞色素P450还原酶基因;在此基础上,通过基因组学、代谢组学和转录组学的整合分析,构建“CYP450基因-代谢物”的调控网络图,筛选与雷公藤甲素积累呈正相关的32条候选CYP450基因,结合不同组织部分转录组分析,挑选出雷公藤根中高表达的10条CYP450基因,利用基因枪介导遗传转化技术对上述10条候选CYP450基因进行干扰表达,在CYP728B70,TW011445.1,TW012149.1,TW006625.1干扰细胞系中,基因表达水平及雷公藤甲素含量均显著下调,经酵母工程菌体系成功鉴定了雷公藤甲素生物合成途径上首个CYP450基因(CYP728B70),体外酶促研究证实其具备连续两步氧化雷公藤甲素二萜烯miltiradiene或abietatriene(miltiradiene自氧化产物)形成相应羧酸产物的生物学功能,并进一步构建酵母工程菌,大量发酵富集产物,制备纯化,进行高分辨质谱以及1H-NMR和13C-NMR鉴定产物结构,成功解析了雷公藤甲素生物合成途径下游两步修饰过程,为雷公藤甲素生物合成途径全解析及其合成生物学生产奠定基础。主要研究结果如下:1.明确雷公藤甲素二萜烯中间体结构采用UPLC/Q-TOF MS检测并比较雷公藤悬浮细胞及培养基、植株不同组织部位之间的代谢物差异,表明雷公藤悬浮细胞选择性地富集雷公藤甲素和雷公藤红素,进一步佐证其可用于解析雷公藤甲素生物合成途径;利用GC-MS检测到雷公藤悬浮细胞中含有松香烷型二萜烯miltiradiene,并通过miltiradiene饲喂悬浮细胞,发现雷公藤甲素累积量相对于对照组显著增加,证实miltiradiene为雷公藤甲素二萜烯中间体化合物。2.筛选出调控雷公藤甲素二萜烯中间体形成的关键候选酶基因深入挖掘雷公藤转录组数据,获得二萜合酶基因TwCPS4、TwKSL1全长序列;利用丹参SmMS氨基酸序列作为query序列,与雷公藤悬浮细胞转录组序列进行比对获得单萜合酶基因TwMS,生物信息学分析表明:TwCPS4,其N端有‘DxDD'结构功能域,与TwCPS1聚为一类,推测其具有催化GGPP质子化并环化成(+)-CPP的功能;TwKSL1,其C端有‘DDxxD’结构功能域,与TwKS聚为一类,推测其具有催化ent-CPP去磷酸化并环化成二萜烯的功能;TwMS与TwTPS27聚为一类,推测其具有催化(+)-CPP去磷酸化并环化成miltiradiene的功能。3.揭示了雷公藤甲素从线性GGPP环化成松香烷型二萜烯中间体的生物过程克隆得到2条可能参与miltiradiene合成的萜类合酶TwCPS4、TwMS,及1条调控未知二萜烯合成的萜类合酶TwKSL1,异源表达及体外功能表征证实TwCPS4 催化 GGPP 形成(+)-CPP,TwKSL1 催化 ent-CPP 形成ent-pimara-8(14),15-diene、8α-hydroxy-ent-pimar-15-ene、ent-kaurene,TwMS 催化(+)-CPP 形成 miltiradiene;进一步表征 TwCPS1、TwCPS4、TwMS 的体内生物学功能,成功揭示了雷公藤甲素从线性GGPP环化成松香烷型二萜烯中间体miltiradiene的生物过程,本研究推动了雷公藤甲素生物合成途径的解析进程,并为下游合成途径CYP450基因研究奠定基础。4.雷公藤NADPH-细胞色素P450还原酶基因克隆及功能研究深入挖掘雷公藤转录组数据,筛选并克隆得到4条NADPH-细胞色素P450还原酶基因,成功构建原核表达载体HIS-MBP-pET28a,并诱导出可溶性蛋白,体外酶活表征显示4个CPR的酶活性(即供电子能力)基本相同;进一步与已知功能的雷公藤贝壳杉烯氧化酶(TwKO)共转化酵母工程菌,发现TwKO与CPR3 组合时,ent-kaurenoic acid、16α-hydroxy-ent-kaurenoic acid 的产量相对较高,表明CPR3具有更高效的供电子能力,推测CPR3更适合应用于雷公藤中其他CYP450单加氧酶的功能研究。5.成功鉴定了雷公藤甲素生物合成途径中首个CYP450基因,解析了雷公藤甲素从miltiradiene氧化成dehydroabietic acid的生物过程整合基因组学、代谢组学和转录组学数据,构建“CYP450基因-代谢物”的调控网络图,筛选出与雷公藤甲素积累呈正相关的32条候选CYP450基因,结合不同组织部分转录组分析,挑选出雷公藤根中高表达的10条CYP450基因;利用基因枪介导遗传转化技术对上述10条候选CYP450基因进行干扰表达,在CYP728B70,TW011445.1,TW012149.1,TW006625.1 干扰细胞系中，基因表达水平及雷公藤甲素含量均显著下调,结合CYP728B70的功能注释信息,推测其可能参与雷公藤二萜烯中间体miltiradiene的氧化反应;经酵母工程菌体系确认CYP728B70能够催化miltiradiene形成新的产物,进而通过大量发酵、产物制备分离纯化、高分辨质谱以及1H-NMR和13C-NMR鉴定其产物结构,即8,12-abietadienol、dehydroabietinol、8,12-abietadienoic acid、dehydroabietic acid;利用底物饲喂明确了 CYP728B70催化过程,成功解析了雷公藤甲素从miltiradiene氧化成dehydroabietic acid的生物过程;借助基因枪介导转化在雷公藤悬浮细胞中过表达CYP728B70酶基因,进一步表征了 CYP728B70在雷公藤甲素合成过程中的调控作用。综上所述,本研究综合运用了前体底物饲喂、基因克隆及异源表达、体外酶促反应、酵母工程菌、制备产物分离纯化、基因枪介导转化的干扰及过表达等技术对雷公藤中雷公藤甲素生物合成途径进行解析。本研究成功揭示了雷公藤甲素从线性GGPP环化成松香烷型二萜烯中间体miltiradiene的生物过程,并进一步鉴定了雷公藤甲素生物合成途径首个CYP450基因(CYP728B70),证实其完成连续两步氧化反应,即氧化二萜烯中间体miltiradiene(或abietatriene)形成8,12-abietadienol(或 dehydroabietinol)并进一步氧化生成 8,12-abietadienoic acid(或dehydroabietic acid)的生物学功能。以上研究成功解析了雷公藤甲素生物合成途径中从线性GGPP至dehydroabietic acid四步催化过程,为雷公藤甲素生物合成途径全解析及其合成生物学生产奠定基础。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.239;Q78
【图文】：

生物合成途径,活性成分

１．１．３逦二萜活性成分生物合成途径解析逡逑二萜类活性成分由４个异戊二烯单元组成，是萜类活性成分的重要组成部分，逡逑紫杉醇、银杏内酯、冬凌草素、夏至草素、毛喉素、土槿甲酸、鼠尾草酚、巨大逡逑戟醇、假白榄酮、丹参酮、穿心莲内酯、新穿心莲内酯、雷公藤福定、雷公藤甲逡逑素等都是典型的二萜类活性成分，在植物中其主要通过ＭＥＰ途径生成，在陇牛逡逑儿基栊牛儿基焦磷酸合酶（ＧＧＰＰＳ）作用下催化３个丨ＰＰ分子与１个ＤＭＡＰＰ分逡逑１７逡逑

骨架结构

逦中国中医科学院２０１６级博士研究生学位论文逦逡逑子首尾相连生成栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸（ＧＧＰＰ），在二萜合酶（ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ逡逑ｓｙｎｔｈａｓｅ）的作用下形成多种多样的二ＩＳ骨架结构（图１－２），再通过ＣＹＰ４５０等逡逑后修饰酶的作用形成结构多样的二萜类活性成分。逡逑

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