电化学发光细胞传感及单细胞成像分析

发布时间：2020-06-23 15:58

【摘要】：电化学发光(ECL)是一种由电化学反应所引起的高能电子转移的化学发光现象。ECL将电化学和化学发光两种检测技术相结合,具有线性范围宽、背景信号低、可控性高和选择性好等特点。在分析化学研究领域中,ECL已成为一种强有力的检测手段。使用ECL技术进行细胞分析或细胞成像时,由于细胞在常规电极上存在空间位阻,使得细胞覆盖区域的ECL反应很难发生或不能充分进行,这限制了ECL技术在细胞分析中的应用。为此,本文借助于通透性基底建立了无细胞空间位阻的ECL分析方法,并应用到ECL细胞传感和单细胞ECL成像分析。主要内容如下:1.壳聚糖膜修饰电极上单细胞直接ECL成像单细胞成像技术能够在单细胞水平上准确地反映出细胞之间的异质性,该技术在阐明细胞的相关功能及生物学机制时起到至关重要的作用。电化学发光(ECL)显微成像技术凭借其高通量和零细胞背景光的特点,一直被认为是一种非常有用的细胞研究工具。然而,由于细胞固定在电极表面之后,电极上细胞的空间位阻和细胞膜的高度绝缘性使得细胞的ECL成像很难实现。为了解决这个问题,我们制备了壳聚糖膜和纳米二氧化钛修饰的FTO电极(FTO/TiO2/CS),并在该电极上成功实现了单细胞的直接ECL成像。具有通透性的壳聚糖膜不仅有利于活细胞的贴壁,还增加了细胞底部和电极之间的距离。壳聚糖膜抬升了细胞之后,使得更多的ECL试剂进入细胞下方,从而提高了定量分析的灵敏度。电极上纳米二氧化钛的修饰,可以增强电极在鲁米诺溶液中可视化的ECL信号,提高细胞成像时的信噪比。基于FTO/TiO2/CS电极,建立了ECL光强和过氧化氢浓度的关系,并在单细胞水平上分析了药物刺激下的过氧化氢释放情况。据我们所知,我们的工作首次实现了没有细胞空间位阻的单细胞ECL成像。并且为传统的电极修饰技术应用到电化学发光可视化分析,尤其是细胞ECL成像分析提供了新思路。2.基于石墨烯水凝胶的ECL传感器对骨骼肌细胞表面GLUT4表达水平分析细胞表面受体的原位检测是近年来研究的热点。本文提出了一种灵敏检测人骨骼肌细胞(HSMC)表面葡萄糖转运体4(GLUT4)表达的电化学发光方法。石墨烯水凝胶(GH)作为可渗透电极,能够克服细胞-电极间空间位阻,增加了细胞表面受体分析的准确性。将碳点(CDs)标记到细胞上后,可以在GH与细胞界面(细胞下表面)产生ECL发射,细胞表面大约一半的GLUT4可以得到检测。所制备的GH细胞传感器对HSMC细胞表现出良好的分析能力,可以检测出500～1.0 × 106 cells·mL-1浓度范围内的HSMC细胞,检出限可达200 cells·mL-1。通过计算,平均每个HSMC细胞表面表达1.88 × 105个GLUT4分子。此外,在胰岛素的作用下,HSMC表面的GLUT4表达水平提高了2.3倍。该策略可对细胞表面的受体进行合理评估,从而推动ECL在疾病诊断中的应用。3.电位分辨ECL同时评估两种细胞表面受体及单个凋亡细胞的可视化诊断单细胞分析有助于我们深入理解细胞行为和细胞间通信,能够为现代生物学和医药学的研究提供许多细节信息。本实验开发了一种电位分辨电化学发光(ECL)方法,并将其用于凋亡细胞的诊断。白藜芦醇(RVL)处理MCF-7细胞之后,细胞表面表皮生长因子受体(EGFR)表达水平降低。同时,RVL可以诱导细胞凋亡,促进细胞膜上磷脂酰丝氨酸(PS)外翻,细胞表面PS表达增多。本实验以Au@L012和g-C3N4作为ECL探针,并分别用表皮生长因子(EGF)和肽段(PSBP)进行功能化,之后与细胞表面的EGFR和PS进行识别结合。两种ECL探针在同一电位扫描过程中呈现出两个峰电位充分分离的ECL信号。Au@L012和g-C3N4的ECL变化反映着细胞凋亡程度,这为研究细胞凋亡提供了新的途径。重要的是,该方法可以同时评估细胞表面EGFR和PS的表达水平,并可以在ECL显微镜下实现单个凋亡细胞的可视化诊断。该策略有助于肿瘤标志物的可视化研究,推动ECL成像技术在单细胞水平上诊断疾病的应用。
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q2-33;O657.1
【图文】：

Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＷＣＮＴ－ｂａｓｅｄ邋ＥＣＬ邋ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ逡逑灿等＿就利用ＣＱＤｓ设计了针对癌胚抗原（ＣＥＡ）免疫检测的ＥＣＬ传感器。逡逑如图１－５，他们将四环素酸（ＰＴＣＡ）以非共价的方式修饰到石墨烯上，然后与ＣＱＤｓ逡逑和邋ＡｕＮＰｓ复合，形成ｇｒａｐｌｉｅｎｅ－ＰＴＣＡ－Ｃｕ２—－ＣＱＤｓ／ＡｕＮＰｓ纳米复合物。ＰＴＣＡ和逡逑ＣＱＤｓ在共反应剂Ｓ２0８２－中起协同作用，提高ＥＣＬ强度。ＡｕＮＰｓ连接二抗Ａｂ２后，逡逑可以被捕获到己经负载一抗ＡｂｊＰＣＥＡ的电极上，构成针对ＣＥＡ检测的夹心免疫逡逑传感器。此传感器可以对１邋ｘ邋ｌ0＿３￣ｌ邋ｎｇ＇ｍＬ－１的浓度范围内的ＣＥＡ进行灵敏检测，逡逑检出限可达２．６ｘｉ0４邋ｆｇｍＬ－ｉ。在对各种癌症样品检测实验中，体现出较好的特逡逑异性识别能力。逡逑疆＿美媝逡逑Ｇｒａｐｈｅｎｅ逡逑ｅｔ逡逑ｔ逦ｔ逦ＨＡｕＣｌｆ逡逑图１－５邋ＥＣＬ免疫传感器的构建及ＣＥＡ的检测原理Ａ逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ＥＣＬ邋ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ邋ａｎｄ邋ＥＣＬ邋ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ．逡逑７逡逑

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本文编号：2727566