猪肉脂肪酶基因的克隆表达及其在食品中的应用研究

发布时间：2020-06-26 17:25

【摘要】：脂肪酶能够水解脂肪,形成脂肪酸等风味前体物质,是一种广泛应用的催化剂。实验室前期研究结果表明,猪肉内源性脂肪酶对肉品及奶制品的风味均有所改善,为进一步验证脂肪酶功能,本文从猪肉中克隆了脂肪酶基因LPL,并在大肠杆菌中进行原核表达,考察重组脂肪酶对猪肉、奶制品、淀粉作用效果,从分子水平和酶水平解析猪肉脂肪酶对食品风味的作用机制,为脂肪酶工业化生产提供新思路。研究结果如下:1.根据GenBank数据库中收录的LPL基因序列,经RT-PCR扩增得到LPL基因,测序结果经BLAST比对,同源性为99%,构建的LPL基因大小为1756 bp,编码478个氨基酸。构建的重组质粒pET30a-LPL在大肠杆菌中成功表达。重组菌在IPTG浓度为0.4 mM,诱导时间5 h时达到最大表达量,温度对表达量的影响较小。经镍柱亲和层析纯化得到一条单一的目的条带,与预测重组蛋白理论分子量大小一致为53.58 kDa。经测定重组酶蛋白浓度为189μg/mL,酶活力为0.932 U/mL。重组酶pH稳定性良好,最适pH和最适温度分别为pH 8.0和40℃,且对于低浓度的甲醇、丙三醇,重组酶有很好的耐受性。2.将重组脂肪酶和内源性猪肉脂肪酶分别作用于猪肉中,测定脂肪水解氧化指标,结果显示:经脂肪酶处理后的过氧化值、硫代巴比妥酸值(TBA)、羰基价、双烯值均高于空白对照组,表明重组酶具备同内源性脂肪酶相似的作用,对脂肪水解氧化有正向的影响。电子鼻结合GC-MS检测猪肉风味,共检测出36种挥发性风味物质,主要为烃类、杂环和芳香族化合物、有机酸和酯类、醛类、酮类、醇类等,其中经重组酶与内源酶处理后的猪肉醛类风味成分相对含量增加,且重组酶的效果优于内源酶,进一步表明重组酶能促进猪肉风味物质增加,增强猪肉风味。3.电子鼻检测添加内源酶与重组酶后奶制品风味有明显改变。GC-MS检测奶制品样品中挥发性成分主要为有机酸和酯类、烃类、醛酮类及杂环和芳香族类物质等,奶制品样品中呈现奶香味的挥发性物质2-十一酮、2-庚酮、2-壬酮等相对含量均明显提高,表明重组酶能够酶解乳脂肪产生风味物质,有效改善奶制品的风味。4.以淀粉为例,考察重组脂肪酶与内源性的脂肪酶对多糖水解的作用效果。当内源酶的加酶量为2.0 mL,淀粉浓度为6%,反应温度为50℃,体系pH值为6时,淀粉的水解程度达到最高,水解出葡萄糖含量为1.01 mg;当重组酶的酶添加量为2.0 mL,淀粉浓度为6%,反应温度为55℃,体系pH值为8时,淀粉的水解程度达到最高,水解出葡萄糖含量为1.32 mg。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS202.3;Q78
【图文】：

表达载体,猪肉,锦州,脂蛋白脂肪酶

是一种特殊的甘油三酯水解酶，存在于动物、植物和霉菌、酵母泛应用于粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业等酶之后，销量第三位的食品酶制剂。随着现代分子生物学技术的难以提取或者提取成本较高的蛋白，通过基因工程表达系统表达品，从而满足人们的需求。鉴于本课题前期验证内源性的猪肉脂[30][60]的风味有积极作用，且有文献[16]表明脂蛋白脂肪酶（LPL）重要候选基因。为此，为进一步验证猪肉脂肪酶对食品风味的影克隆 LPL 基因，并构建表达载体 pET30a-LPL。方法料自辽宁锦州新玛特超市。菌种30a、感受态细胞大肠杆菌 BL21(DE3)锦州医科大学畜牧兽医学

RT-PCR扩增,鉴定结果,酶切鉴定,重组质粒

图 2-1 猪 LPL 基因 RT-P-1 Results of LPL gene RT注：M: DL2000 DNA Marker 1 :LPL 鉴定结果酶切鉴定结果重组质粒 PCR 鉴定与位置的条带，即在 102000b10001 1756bp

【参考文献】