环介导等温扩增技术对诺如病毒检测的研究

发布时间：2020-06-29 14:49

【摘要】：核酸等温扩增技术(Isothermal amplification technology)的反应过程始终维持在恒定温度,不需要精密的温度控制仪器,在体外核酸检测方面有独特的优势,是一种便利的体外核酸快速检测方法。而环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是在60-65℃条件下,通常在一小时内进行核酸扩增,是一种强大的等温核酸扩增方法,反应产生大量焦磷酸镁白色沉淀,所以可以通过肉眼观察来判断靶基因是否存在。但缺点是在反应过程中常发生非特异性扩增而产生假阳性信号。为了提高检测结果的准确性,本论文分别将LAMP扩增与一步链置换反应(One-step strand displacement,OSD)和杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)联用,并分别借流式细胞仪、血糖仪等最终实现了诺如病毒基因的多手段灵敏检测。在磁球协助的分离纯化后,实现了在外加粪便中检测到了30个拷贝的诺如病毒DNA。具体研究内容如下:LAMP与OSD联用,借助实时荧光定量PCR仪检测诺如病毒:普通的DNA染料(Evagreen)没有特异性识别DNA序列的功能,而OSD探针可对LAMP产物进行特异性识别。因而,通过LAMP-OSD的偶联,通过优化反应条件,可以避免假阳性问题。但是,在粪便溶液中检测诺如病毒或者加入具有干扰性的轮状病毒LAMP产物时,LAMP-OSD荧光信号易受影响,而不利于信号的检测。LAMP与HCR联用,借助流式细胞仪检测诺如病毒:本研究提出了LAMP与HCR联用型基因检测新技术,并对该联用技术的可行性、必要性和技术优势进行了验证。带有荧光基团的DNA在磁球表面发生LAMP-HCR扩增。将带有LAMP-HCR产物的磁球应用流式细胞仪进行检测,最低可检测到30拷贝的诺如病毒基因。由于磁球的分离纯化作用,即使加入不同百分比的粪便样品(0.1%~2%),检测效果完全没有受到影响。LAMP与HCR联用,借助血糖仪检测诺如病毒:带有蔗糖酶的DNA在上述的磁球表面发生LAMP-HCR扩增,然后将带有扩增产物的磁球与蔗糖混合,蔗糖酶会水解蔗糖为葡萄糖,进而可用血糖仪进行检测。在2%的粪便样品中,也可检测到30拷贝的诺如病毒基因,同时还可实现诺如病毒的现场快速诊断。
【学位授予单位】：长春理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O652;Q52
【图文】：

曲线,琼脂糖凝胶电泳,产物,浊度仪

图 1.2 LAMP 产物的琼脂糖凝胶电泳分法时检测在实时浊度仪的帮助下通过浑浊度，由此得到浊度曲线（图 1.靶标可明显降低成本。为了观察到R 扩增比 LAMP 扩增需要更多的待在 PCR 体系中，由于温度高于 94磷酸根离子的量很少，不易观察到种具有应用前景的诺如病毒检测化是检测基因扩增的简单方法[30]。

曲线,浊度,实时监测,曲线

图 1.2 LAMP 产物的琼脂糖凝胶电泳分析时浑浊度检测法P 放大反应的实时检测在实时浊度仪的帮助下通过分光光度法完成每 6 s 记录一次浑浊度，由此得到浊度曲线（图 1.3）。与昂贵的实时应用浊度仪检测靶标可明显降低成本。为了观察到焦磷酸盐的白色扩增体系中，PCR 扩增比 LAMP 扩增需要更多的待检测物，因此 P度较低。另外，在 PCR 体系中，由于温度高于 94 ℃，PCR 过程中解成磷酸盐，焦磷酸根离子的量很少，不易观察到白色沉淀的产生浑浊度检测法是一种具有应用前景的诺如病毒检测手段。因此利用扩增后的浊度变化是检测基因扩增的简单方法[30]。

【参考文献】