嗜热链球菌β—半乳糖苷酶的转糖基活性研究及表面展示系统的建立

发布时间：2020-07-02 20:29

【摘要】：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是一类重要的食品安全级菌株,常用于酸奶或奶酪等乳制品的生产。嗜热链球菌利用胞内的β-半乳糖苷酶将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖,前者通过糖酵解途径转化成乳酸,而后者不能被消耗并全部泵到细胞外,导致乳制品中残留了大量的半乳糖和部分未被利用的乳糖,不利于人类健康。除此之外,β-半乳糖苷酶还能够发挥转糖基活性生成低聚半乳糖(GOS),减少发酵乳中半乳糖的残留。因此,调节其分解活性与转糖基活性有助于生产低糖健康的乳制品,然而对其转糖基活性的相关位点少有报道,限制了其在食品工业的应用。近年来,由于细胞固定化酶有更好的催化活性和稳定性,乳酸菌表面展示系统得到迅速发展,而关于嗜热链球菌表面展示系统的报道较少。本文主要利用生物信息学分析对S.thermophilusSDMCC050237的β-半乳糖苷酶进行理性改造,从而提高其转糖基活性,同时鉴定并研究了嗜热链球菌的烯醇化酶的表面锚定功能及用于表面展示的潜力。具体的实验结果如下:1.嗜热链球菌中高活性p-半乳糖苷酶的筛选β-半乳糖苷酶对嗜热链球菌的食品工业应用有重要意义。本文使用X-Gal平板检测了嗜热链球菌产β-半乳糖苷酶的能力并以oNPG为底物检测了酶活,发现不同菌株的β-半乳糖苷酶之间存在活性差异。将活性较高的细胞破碎液与乳糖溶液混合反应后利用TLC法初步分析了反应液中糖的成分,结果表明,不同菌株的β-半乳糖苷酶在自然条件下转糖基活性较弱且无明显差距,导致其发酵液中残留了较多的半乳糖。2.β 半乳糖苷酶BgaQ的酶学性质研究及其转糖基活性条件的优化以 S.thermophilus SDMCC050237为材料,克隆其β-半乳糖苷酶基因bgaQ,使用表达质粒pET28a(+)在E.coli DE3中过表达BgaQ蛋白。镍柱亲和层析纯化后获得目标蛋白(113 kDa)。以oNPG和乳糖为底物时BgaQ的酶活分别为4725.3±155.4 U/mg和88.3±1.4U/mg。酶学性质表明,BgaQ的最适温度为50℃,温度耐受范围为37℃～60℃,高温下稳定性下降;最适pH为8.5,pH值稳定性较高。另外,Na-、K-、Mg2-、Ba2+和Co2+促进酶活,而Fe2+、Ni2-和Co2+抑制酶活,该酶对Zn2-和Cu2-不耐受。转糖基活性的条件优化结果表明,该酶生成GOS的最优乳糖浓度为25%,最优温度为50℃,最优pH为6.5。优化后的反应条件为15%的乳糖浓度,pH=6.5,50℃条件下反应5 h,GOS的转化率为45.0±3.4%。3.定点突变提高β-半乳糖苷酶的转糖基活性嗜热链球菌的β-半乳糖苷酶具有分解活性和转糖基活性,其工业应用具有重要意义和广阔前景。为了提高嗜热链球菌β-半乳糖苷酶的转糖基活性,本文对筛选出的β-半乳糖苷酶BgaQ进行同源建模,通过序列叠合找到了两个谷氨酸活性位点,以β-3'-galactosyl-lactose为底物进行Autodocking分析,获得转糖基活性相关位点并通过序列比对分析成功构建了Y801H/P802G突变体蛋白mBgaQ。以oNPG和乳糖为底物测得mBgaQ的酶活力分别为5957.7±209.1 U/mg和81.9±3.6 U/mg,以乳糖为底物时mBgaQ的酶活力基本与野生型相同。酶学性质表明,mBgaQ的最适温度为50℃,在37℃～45℃能发挥活性,对高温的耐受性显著下降;最适pH为8.5,在酸性和中性环境下稳定性较好,在碱性环境下稳定性下降。Na+、K+和Mg2+促进酶活,Zn2+、Ni2++、Mn2+和Co2+抑制酶活,且该酶对Cu2+不耐受。转糖基优化结果显示,mBgaQ生成GOS的最佳乳糖浓度为25%,最佳pH为6.5,最佳反应温度为42℃。优化后的反应条件为:115%乳糖浓度、pH=6.5、50℃下反应5h,最终生成GOS的转化率为58.3±1.4%,与野生型相比提高了 13%。另外,本文检测了低乳糖浓度时mBgaQ与BgaQ生成GOS量以及残留半乳糖量的时间曲线,发现mBgaQ生成GOS的转化率最高为26.7±0.5%,比BgaQ提高了6%,其残留的半乳糖量也低于BgaQ。4.基于烯醉化酶建立嗜热链球菌的表面展示系统烯醇化酶是糖酵解途径的关键酶,不仅能在胞质内发挥活性,还能分泌到细胞表面,是一种间歇蛋白(moonlighting protein)。本文从Sthermophilus CGMCC7.1 79的基因组中找出烯醇化酶编码基因eno M,将EnoM蛋白序列与致病性链球菌的烯醇化酶蛋白序列进行了比对分析,发现具有高度同源性,这表明其烯醇化酶具有表面展示的潜能。随后我们用pET28a(+)质粒分别将GFP蛋白和GFP-EnoM融合蛋白在E.coli DE3中过表达并纯化,结合反应结果显示,与GFP-EnoM融合蛋白孵育的菌体细胞荧光强度显著提高,说明EnoM将GFP蛋白锚定在细胞表面。为了探索EnoM的锚定原理,用不同化学试剂处理菌体细胞,发现经过SDS处理的细胞基本检测不到荧光,表明EnoM与细胞表面的蛋白质结合。对EnoM在乳酸菌中的适用性进行探究,发现其在其它乳酸菌中也具有表面锚定功能。为了进一步证实EnoM的表面展示功能,将分子量较大的β-半乳糖苷酶mBgaQ展示到嗜热链球菌的表面并保持了酶的活性,固定化酶在反复利用8次后仍然维持64%的酶活。为了验证EnoM能否在嗜热链球菌中实现靶向表达,构建了S.thermophilus CGMCC7.179/pLEISS-D2-gfp-enoM重组菌株,提取其胞内蛋白和表面蛋白进行Western Blot检测,发现GFP-EnoM蛋白成功表达但是没有锚定到细胞表面,可能与分泌量不足或者嗜热链球菌致病性的缺失有关。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.3
【图文】：

乳酸菌,锚定,方法,异源蛋白

物活性物质打力的备选者（Ｂｅｒｍｕｄｅｚ－Ｈｕｍａｒａｎ邋ｅｔ邋ａＬ邋２０丨３）。重组酶在乳酸菌中表达后存逡逑三种去向：运输到细胞质、分泌到胞外或锚定到细胞表面。在胞内过量表达目的蛋白会逡逑对宿主的生长和代谢产生负担（Ｍｉｎｎｉｎｇｅｔａｌ．ＪＯＯｌ），而蛋白分泌到环境中会被稀释并且逡逑易于被降解，同T环境中的ｐＨ值和胆盐都会降低酶的活性（Ｂｅｍｕｉｄｅｚ－Ｈｉｉｍａｒａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２００４），而锚定到细菌表面尤其是细菌细胞壁能够更好地保护异源蛋白。因此将蛋白锚逡逑定在微生物表面维持酶的活性并且增加其浓度成为近年来研宄的热点。逡逑１．４．１表面展示的基本原理及应用逡逑异源蛋白在乳酸菌中的表面展示通过共价结合或非共价结合完成，前者包括Ｎ端的逡逑跨膜结构域锚定模型、脂蛋白锚定模型、ＬＰＸＴＧ模型，后者是指基于ＬｙｓＭ结构域的逡逑锚定模型和表层蛋白（ｓｕｒｆａｃｅｌａｙｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳＬＰｓ）同源描定模型（图１－３）。值得注意逡逑的是，不同的表面展示系统会＾？？致＋邋Ｍ的锚定效率并对宿主菌产生不同的影响（Ｋａｊｉｋａｗａ逡逑ｅｔ邋ａＬ邋２０１１），因此当进行表面展示时需要探宄并评估不同表面展示方法的效果以寻找最逡逑优的表面展示策略。逡逑

半乳糖苷酶,嗜热链球菌

嗜热链球菌的划线活化，４２°Ｃ静置培养２４邋ｈ后观察菌落，发现均呈蓝色，且变蓝色的程逡逑度不同，说明嗜热链球菌能够产生Ｐ－半乳糖苷酶且不同菌株之间的Ｐ－半乳糖苷酶的活性逡逑存在差异（图２－１）。逡逑■邋■国逡逑ＳＤＭＣＣ０５０２３６逦ＳＤＭＣＣ０５０２５７逦ＳＤＭＣＣ０５０２２０逡逑瞻~|逡逑ＳＤＭＣＣ０５０２３７逦ＳＤＭＣＣ０５０２４２逦ＳＤＭＣＣ０５０２２９逡逑图２－１产ｐ－半乳糖苷酶的嗜热链球菌筛选结果。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｏｆ邋Ｓ．邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ邋（３－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．逡逑２．２．２嗜热链球菌ｐ－半乳糖苷酶活性的检测逡逑通过Ｘ－Ｇａｌ平板筛选法对嗜热链球菌产Ｐ－半乳糖苷酶的能力进行了初步检测，为了逡逑对其Ｐ－半乳糖苷酶的酶活力进行测定，将嗜热链球菌细胞破碎并获得胞内破碎上清，以逡逑ｏＮＰＧ为底物，检测卩－半乳糖苷酶的活性。结果如图２－２所示，不同的嗜热链球菌其胞逡逑内（３－半乳糖苷酶的活性存在一定的差异，体现了菌株的特异性。逡逑１０ｒ逡逑Ｋ邋■逡逑Ｉ邋６逡逑ａ．逡逑Ｃ＿逡逑—逦—邋—邋ｗ＊．邋—逡逑ｒ＾ｌ邋ｒ－ｌ邋ｒ邋Ｊ邋ｒ＇ｌ逦ｒ＾ｔ邋ｆ－＇ｉ逦ｒ＾ｉ邋ｒ＾ｉ邋ｎ邋ｒ＾ｔ邋ｒ￣４逦ｒ＾ｔ逦ｒ邋ｉ邋ｒ－ｔ逦ｒ－ｔ逦ｒ－ｔ逦ｒ逦ｉ逡逑｜｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜邋Ｉ邋Ｉ邋｜邋ｉ邋Ｉ邋１邋§邋§邋｜邋Ｉ邋｜邋§邋｜邋Ｉ邋§邋§逡逑Ｗ邋ｗ邋ｗ邋ｗ逡逑７邋７邋＾邋７邋７

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