草鱼白细胞介素21的免疫功能鉴定及其作用机制研究

发布时间：2020-07-03 08:50

【摘要】：哺乳动物白细胞介素21(interleukin-21,IL-21)是一种含四?螺旋簇结构的新型细胞因子,属于共用受体?链家族成员,主要由活化的CD4~+T细胞以及自然杀伤T(natural killer T,NKT)细胞产生,且在Th17细胞以及滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell,Tfh)类群中高表达。IL-21作为一种多效性的细胞因子,能够作用于不同的免疫细胞以及非免疫细胞,在固有和获得性免疫系统中均发挥重要作用。尽管哺乳动物IL-21的功能研究已较为透彻,但硬骨鱼IL-21的免疫调节功能还知甚少,仅有虹鳟IL-21的部分功能被报道。本研究拟探究草鱼IL-21的免疫学功能。为此,首先克隆获得草鱼IL-21(Grass carp IL-21,gcIL-21)的编码序列(Coding sequence,CDS),共450 bp,编码149个氨基酸。然后,构建原核表达系统并结合变复性方法获得重组草鱼IL-21蛋白(Recombinant gcIL-21,rgcIL-21),再利用此蛋白制备草鱼IL-21多克隆抗体并验证抗体特异性。之后,使用此抗体,以草鱼头肾白细胞(Head kidney leukocytes,HKLs)为模型,免疫印迹实验检测培养基上清中草鱼IL-21的蛋白表达量,结果表明热失活的嗜水气单胞菌能够明显促进HKLs分泌草鱼IL-21,提示草鱼IL-21可能参与调节炎症反应。随后,rgcIL-21的生物学活性被验证,结果显示rgcIL-21能够上调HKLs中草鱼IFN-γ和SCOC3的mRNA表达。进一步研究发现,rgcIL-21处理草鱼HKLs后,能够以时间和剂量依赖方式显著刺激草鱼IL-10的mRNA表达,并促进草鱼IL-10的蛋白分泌,提示草鱼IL-21可能通过诱导IL-10的产生发挥免疫抑制作用。相关机制研究发现,MAPK信号通路中的MEK和JNK信号通路部分参与了rgcIL-21对草鱼IL-10基因表达的调控,并且,rgcIL-21能够上调STAT3的磷酸化水平,激活STAT3信号通路。与rgcIL-21对IL-10的调控作用一致的是,rgcIL-21能够显著下调热失活的嗜水气单胞菌刺激的HKLs中促炎因子TNF-?和IL-1?的mRNA表达,进一步提示了草鱼IL-21的免疫抑制作用。与此同时,体内实验也表明腹腔注射rgcIL-21一天后能够提高感染了嗜水气单胞菌的草鱼的存活率,并减轻致病菌感染引起的病理反应。本研究首次鉴定了草鱼IL-21的免疫学功能,特别揭示了它在细菌感染的炎症过程中发挥的免疫抑制作用。
【学位授予单位】：电子科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q41
【图文】：

质粒图谱,草鱼,生物信息学分析,分子克隆

第二章草鱼 IL-21 的分子克隆与生物信息学分析第二章草鱼 IL-21 的分子克隆与生物信息学分析验材料实验动物、菌株和质粒验动物：体重 0.5-1 公斤的健康草鱼购买于成都通威水产公司。本论实验均严格按照中华人民共和国《实验动物管理条例》（2017 年第三相关规定进行，并获得电子科技大学动物伦理委员会批准。验菌株：实验所用克隆菌株为大肠杆菌 JM109，由实验室冻存。验质粒：实验所用克隆载体为 pGEM -T Easy，购买自 Promega 公司为其质粒图谱。

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图 2-2 草鱼 IL-21 基因的结构图谱灰色方框和白色方框分别代表外显子的氨基酸编码区和 UTR 非编码区，黑条代表内含子。由 DNAMAN 8.0 翻译草鱼 IL-21 编码序列并导出结果，草鱼 IL-21 的编码列以及它所对应的氨基酸序列如图 2-3 所示，共 149 个氨基酸，预测其中包含一19 个氨基酸的信号肽序列，图中方框内标注为其信号肽序列。

【参考文献】