静电滴注法制备细胞微载体

发布时间：2020-07-07 14:19

【摘要】：细胞微载体通常是指能够适用于贴壁依赖型细胞生长的微珠。用于制备细胞微载体的材料可以是天然高分子材料或人工合成高分子材料。细胞微载体由于具有较大的比表面积,因此为细胞提供了更大的生长面积,可以在较小的体积内实现细胞的大量生长和扩增。国外早已将微载体成功用于实际生产之中,而我国对于微载体的开发相对较晚,走向商品化的微载体少之又少,相关产业所使用的微载体还只能主要依赖于进口,价格昂贵。一些生物药物、疫苗、抗体都需要从体外细胞内大量的制备重组蛋白,然而细胞的生长需要微载体提供的这种生长界面,这必然使得以重组蛋白为原料的产品价格居高不下。细胞微载体在提高细胞产出率的同时也极大的提高了产品的成本,因此急需开发一种细胞微载体制备技术来降低产品成本。壳聚糖是一种性质良好的天然高分子聚合物,价格低廉、来源广泛,并具有良好的生物相容性,已经在食品工业、生物医药等领域得到了广泛的应用。本文以壳聚糖为原材料,利用静电滴注法制备了一种单分散型壳聚糖细胞微载体,克服了壳聚糖溶液的粘滞力和表面张力,以获得粒径均匀、球形度好的壳聚糖微球,并在此基础上引入能够与壳聚糖细胞微载体特异性结合的生长因子,进一步增强微载体的生物学活性,使其能够更好地满足贴壁依赖型细胞生长的需求。为了获得条件优良的壳聚糖细胞微载体,本文在壳聚糖细胞微载体的制备过程中,对其制备工艺参数进行了相应的优化,其中包括壳聚糖溶液浓度、针头内径大小、电压大小、加热温度等参数及在不同环境中的稳定性等方面进行了优化,获得了表面较光滑、半透明的壳聚糖细胞微载体,其粒径分布在290~320μm左右,在121℃20min的常规高温高压灭菌条件下,连续高温高压5次并未产生形变,同时能够在蒸馏水中长期保存,性质稳定。以上结果表明,通过静电滴注法制备的壳聚糖细胞微载体,粒径分布均匀、球形度良好,能够利用常规方法灭菌,呈淡黄色半透明状,细胞在其表面粘附、增殖后,可直接利用光学显微镜观察细胞的生长情况。对制备的壳聚糖细胞微载体进行了理化性质检测之后,接下来利用基因工程技术制备了重组生长因子bFGF以及具有特异结合能力的重组生长因子ChtBD-bFGF用于壳聚糖细胞微载体,在生长因子末端引入能够和材料特异结合的几丁质结合结构域(ChtBD),使生长因子具有与材料特异结合的能力。纯化后的bFGF浓度为:400μg/mL,ChtBD-bFGF浓度为:570μg/mL。最后利用浓度为40μg/mL的生长因子浸泡壳聚糖细胞微载体,以200μL/孔的微载体量和2万/孔的细胞数量接种,在48孔板中培养小鼠成骨细胞系(MC3T3-E1)和小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH3T3)。结果表明:MC3T3-E1细胞和NIH3T3细胞均能在其上良好的生长,ChtBD-bFGF能够更好的促进细胞在壳聚糖细胞微载体上的粘附和增殖,自制的壳聚糖细胞微载体可以用于上述两种贴壁依赖型细胞的培养。
【学位授予单位】：长春理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q813
【图文】：

甲壳素,壳聚糖

聚氨葡糖和脱乙酰甲壳素等，是一种天然衍生的多萄糖胺和 N-乙酰葡萄糖胺组成，通过甲壳类动物而来，也存在于一些真菌细胞壁和昆虫表皮中[36]。 55%以上的产物称为壳聚糖。壳聚糖外观一般为白，其脱乙酰度的高低及相对分子质量的大小，是其参数。目前，壳聚糖的研究范围十分广泛，在环境保药等方面都有着广阔的应用前景[37]。构和性质，甲壳素是自然界中发现的第二种最丰富的多糖。团的纤维素（见图 1.1），因此，甲壳素和壳聚糖是。氨基和羟基基团的存在为修饰它们的化学结构提、化学和生物特性，包括溶解性[39]。

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包括制球装置的搭建、壳聚糖乙酸溶液的制备、接收相的制备、静电滴注、以及固化成球。制备工艺流程如图2.1 所示：图 2.1 壳聚糖细胞微载体的制备流程图（1）构建了一种壳聚糖细胞微载体静电滴注装置，该制备装置的示意图如图 2.2所示，其中包括：（A）匀速推进器；（B）静电发生器；（C）步进电机控制装置；（D）温控装置。（2）配制不同比例的壳聚糖乙酸溶液，充分混合均匀，完全溶解后静置消泡，即可得到半透明的壳聚糖乙酸溶液。（3）配制不同比例的氢氧化钠乙醇溶液，充分搅拌溶解，作为接收相。（4）制球过程：步进电机推进器将壳聚糖乙酸溶液匀速的从针头处挤出，挤出的

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.3 壳聚糖细胞微载体的制备方案壳聚糖原材料的选择利用课题组采购的壳聚糖粉末，根据其具体参数条件及溶解后的形态，判断用于制备微载体。壳聚糖细胞微载体的制备流程壳聚糖细胞微载体的制备流程可以分为几个主要部分，包括制球装置的搭建乙酸溶液的制备、接收相的制备、静电滴注、以及固化成球。制备工艺流程所示：

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