Shh信号在牙釉质发育早期功能的研究

发布时间：2020-07-09 20:29

【摘要】：Shh信号在胚胎发育中发挥重要作用,它是脊椎动物牙齿发育的标记物,调控口腔上皮-间充质的信号转导,同时促进早期牙胚的形态发生,并影响牙胚的细胞周期调控和分化,但Shh信号在牙釉质发育早期调控机制目前还不清楚。我们通过原位杂交实验发现Shh信号及其通路分子在刚出生小鼠的成釉质细胞中均有表达,但随着成釉质细胞进入分泌期,其表达逐渐降低并消失,表明Shh信号可能在分泌前的成釉质细胞中有作用。为了准确定义Shh信号在釉质发生过程中的功能,我们构建了由成釉质细胞特异的Amelx基因启动子驱动的、可诱导表达的Amelx-ERCreER小鼠,我们利用该小鼠在分泌前期的成釉质细胞中敲除Shh或Smo基因,都发现了釉质发育不全的表型。据此,我们推测Shh信号可能参与釉基质蛋白的合成或分泌。通过原位杂交和Q-PCR结果分析发现,在分泌前的成釉质细胞中敲除Shh基因会导致釉基质蛋白Amelogenin(Amelx),Ameloblastin(Ambn)和Enamelin(Enam)基因表达显著下调,而且免疫荧光及Western blot实验都发现了釉基质蛋白显著减少,我们又通过体外器官培养,利用Shh重组蛋白激活Shh信号通路,Q-PCR实验结果显示Amelx,Ambn,Enam基因表达上调,以上结果表明Shh信号可能直接参与釉基质蛋白基因表达调控。为了验证我们的推测,我们利用成釉质细胞系ALC细胞,以及P2天野生型小鼠的磨牙上皮进行了ChIP分析,结果发现Gli1,Gli2,Gli3与Amelx,Ambn,Enam的启动子区域均有直接结合,其中Gli2的结合能力最强。为了确定Gli蛋白与Enam启动子的结合区域是否与我们预测的一致,我们又进行了Luciferase实验,结果显示,Gli与Enam启动子结合区域位于-600bp~-1200bp。以上结果表明Shh信号主要是通过Gli直接调控釉基质蛋白基因的表达来参与釉质发生。
【学位授予单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q344
【图文】：

信号通路

1.2.2 Shh 信号对牙胚的形状影响小鼠牙胚发育到牙板期后， Shh 信号开始表达，而在帽状期，当初级出现时，Shh 的表达增强[19]，同时，Ptch1、Gli1-2 和 Smo 均在牙体上皮和充质的重叠区中表达，但他们均在釉质结外表达，初级和次级釉质结是短号转导中心，表达多种信号分子，包括 Shh、Fgf3、Fgf4、Fgf9、Bmp2、Bmp7、Wnt10a 和 Wn10b[20-23]，并确定牙齿形状[24-27]。在小鼠胚胎期 E14.Cre; Shh 条件性敲除 Shh，磨牙持续生长，但是形态被严重破坏，在这一突变小鼠磨牙比野生型小 25%左右，而且形态有所改变，不能达到正常的然而，Fgf4、Bmp2 和 Wnt10b 都在这些牙齿的釉质结中表达，而 Wnt10b在近舌侧有表达，这表明 Shh 的缺失导致细胞命运部分改变，即从舌侧增图 1.2.1 Shh 信号通路图。图 A 通路静息状态下的信号转导，图 B 通路激活状态下的信号转导

小鼠,成釉质细胞,基因

Shh 在小鼠磨牙成釉质细胞中时空表达为了研究 Shh 信号对牙釉质相关基因的关系，我们首先利用冰冻切片观察了 Amelx，Shh 在 B6 小鼠 P0，P2，P4 天磨牙的表达情况，Amelx 0 天 B6 小鼠磨牙成釉质细胞中表达，这一时期 Amelx 在近舌侧牙尖处表达(图 4.1 A)，在小鼠 P2 天，在磨牙牙冠区成釉质细胞中，Amelx 表调(图 4.1 B)，小鼠 P4 天，在磨牙牙冠区成釉质细胞中，Amelx 表达明 4.1 C)，而 Shh 在 P0 天小鼠磨牙牙冠区的成釉质细胞中表达，而牙根(图 4.1 E)；Shh 在 P2 天小鼠磨牙牙冠区的成釉质细胞中表达，而在牙细胞中表达下调(图 4.1F)，Shh 在 P4 天小鼠磨牙成釉质细胞中表达,牙达(图 4.1G)。从原位杂交结果图我们可以看到 Amelx， Shh 的表达区域说明 Shh 信号参与了釉质发生过程，但随着釉质发生的进行，表达逐

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学硕士学位论文合到含有 Neo 和 DTA 筛选基因的打靶载体内，其中 Frt-Neo-的中间。同时用从 Addgene 购买的含有 ERT2-Cre-ERT2表达框增 5’端带有 Kozak 序列的 ERT2-Cre-ERT2-pA 片段，然后将该’同源臂下游的多克隆位点，并保证 Amelx 基因启动子可以启动2的表达。将构建好的载体，经鉴定正确后送去测序（图 4.2.备中抽，酶切，纯化。然后胚胎干细胞基因打靶（图 4.2.2）培养，囊胚注射，胚胎移植，得到嵌合体小鼠，与 B6 小鼠交鉴定，含有目的基因片段的杂合子小鼠为构建成功的 Amelx-。

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