海洋沉积物中琼胶酶基因的表达及其在制备新琼二糖中的应用

发布时间：2020-07-12 07:59

【摘要】：琼胶酶是一类能够降解琼胶生成琼胶寡糖的糖苷水解酶。琼脂寡糖具有多种生理和生物学特性,并且在食品、化妆品和医疗等领域具有潜在的应用价值。利用琼胶酶降解琼胶来制备一系列聚合度不同的琼胶寡糖,被认为是最理想的绿色生产技术。因此,筛选高效产琼胶酶的菌株、挖掘酶学性质优良的琼胶酶以及制备琼胶寡糖都具有重要的实际意义。海洋沉积物中蕴藏着非常丰富的微生物资源,本文分别从近海和深海来源的沉积物中挖掘琼胶酶基因,并建立了以龙须菜为原料制备新琼二糖的技术,主要研究内容及结果如下:(1)自红树林沉积物微生物宏基因组中预测到一条编码氨基酸序列相似性为58.64%的琼胶酶基因agaM1,并利用枯草芽孢杆菌进行胞外表达。重组AgaM1(Recombinant AgaM1,rAgaM1)的最适温度为50°C,最适pH为7.0。rAgaM1具有良好的热稳定性,此外,rAgaM1能够降解龙须菜,产生新琼六糖和新琼四糖;(2)在前期研究中对分离自西太平洋深海沉积物的新种太平洋火色杆菌Flammeovirga pacifica WPAGA1进行了基因组测序,并对与琼脂糖代谢相关酶的基因进行了预测和分析。本文主要针对菌株WPAGA1中唯一的GH50家族的琼胶酶基因aga2660进行深入分析。将琼胶酶基因aga2660克隆并转化到E.coli BL21(DE3)中表达并纯化。结果表明,重组Aga2660(Recombiant Aga2660,rAga2660)与其他GH50家族的琼胶酶不同,可以将低聚合度的新琼寡糖降解为新琼二糖,但是不能作用于大分子琼胶的降解。rAga2660最适温度为30°C,且具有良好的热稳定性,表明该酶在新琼二糖的工业生产中具有较大的应用潜力。(3)以龙须菜为原料,利用rAgaM1和rAga2660联合制备新琼二糖,通过细胞毒性检测和美白功效评估,结果表明,与新琼四、六糖相比,新琼二糖作用于细胞上的安全性大大提高,且新琼二糖的美白功效优于新琼四糖和新琼六糖,表明rAgaM1和rAga2660联用的技术具有较好的应用价值。
【学位授予单位】：自然资源部第三海洋研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;O636.1
【图文】：

示意图,琼胶,酶解法,琼胶酶

6图 1.1 酶解法降解琼胶的示意图[68]Fig.1.1 Schematic diagram of enzymatic hydrolysis of agar[68]酶的分类酶(agarase)是一种能够降解琼脂糖和琼胶的糖苷水解酶，是一种多糖降解酶。琼胶酶裂解糖苷键作用方式的不同，琼胶酶可分为 α-琼胶酶和酶 (EC3.2.1)裂解琼脂糖的 α-1，3-糖苷键，生成以 β-D-半乳糖端和以 3 ， 6- 内醚 -α-L- 半乳糖为还原性末端的琼

氨基酸序列,系统发育树,氨基酸序列,琼胶酶

图 2.2 基于 AgaM1 氨基酸序列构建的系统发育树[113]Fig.2.2 Neighbour-joining tree based on amino acid sequence of agarasesAgaM1[113]2.2.2 琼胶酶基因 agaM1 的克隆表达以红树林沉积物基因组为模板，根据琼胶酶基因 agaM1 的序列设计引物，扩增目的基因片段，电泳结果（图 2.3 a）显示，条带清晰，扩增出的片段大小与预期结果相符。将重组质粒 pHT43-agaM1 转入枯草芽孢感受态 WB800N 细胞中获得表达成功的克隆子。2.2.3 rAgaM1 的 SDS-PAGE 及活性染色结果重组表达菌株在起始 OD值为 0.8、IPTG 终浓度为 0.01 mM、30 °C、pH

琼胶酶,诱导表达,活力,表高

.3 agaM1 PCR 扩增（a）和 rAgaM1 的 SDS-PAGE 及活性染色结果（：M 为 DNAMarker，1 为 agaM1 扩增结果；b：M 为蛋白 Mark加 IPTG 诱导表达，2 为加 IPTG 诱导表达，3 为活性染色结果）.2.3（a） PCR ampilification of agaM1 gene；（b）SDS-PAGE analysiactivity staining of rAgaM1gaM1 诱导表达条件的优化结果度和 IPTG 浓度对 rAgaM1 表达的影响0 °C -30 °C（图 2.4 a-c）条件下，诱导的前 3 h 琼胶酶活力非常低活力达到顶峰。在 35 °C（图 2.4 d）下诱导，前 3 h 琼胶酶已大量表高，之后酶活力逐渐降低。40 °C 和 50 °C（图 2.4 e-f）条件下，在琼胶酶活力达到最高。

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