p62及其互作蛋白Vps34在LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬中的作用

发布时间：2020-07-12 14:24

【摘要】：自噬是细胞内发生功能障碍的组分进行自我降解的一种过程,在维持细胞内稳态的过程中起着重要作用。p62/SQSTM1蛋白作为一种接头蛋白可以调控自噬的发生,同时也可以被自噬途径降解。此外,p62蛋白还可以通过与不同蛋白相互作用来调控不同的信号通路,深入开展p62蛋白的功能研究对于探索细胞自噬过程以及相关的信号转导途径具有重要意义。在本研究中,我们对p62蛋白进行了亚细胞定位分析;使用mTORC1的特异性抑制剂Rapamycin处理小鼠巨噬细胞,观察mTORC1信号通路对p62基因表达的调控作用;构建mTORC2特有组成成分Rictor的靶向shRNA表达载体,并转染小鼠巨噬细胞,观察mTORC2信号通路对p62表达的影响;小鼠巨噬细胞中过表达p62基因,Western blot检测mTORC1和mTORC2信号通路活性变化;利用免疫共沉淀技术获得可以与p62蛋白相互作用的靶蛋白,对这些蛋白进行质谱测序及Western blot验证;使用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠巨噬细胞发生自噬,并通过观察自噬小体形成及自噬相关蛋白Beclin-1和LC3水平的变化,确定p62在LPS诱导细胞自噬过程中的作用;同时,分析与p62蛋白相互作用的靶蛋白,研究这些靶蛋白对LPS诱导细胞自噬的影响。结果表明:1)用绿色荧光标记的p62蛋白可以与红色荧光标记的内质网和高尔基体发生重合,p62可以定位于内质网和高尔基体;2)质谱检测和免疫共沉淀结果表明,p62蛋白、Vps34及FKBP38蛋白相互作用,蛋白相互作用网路分析显示Rictor与p62、FKBP38具有相互作用关系,预示mTORC2可能与p62相关联;3)当mTORC1和mTORC2的活性受到抑制时,p62基因表达显著降低(p0.05);在小鼠巨噬细胞中过表达p62基因,提高mTORC1和mTORC2通路活性,反之转录后沉默p62基因则降低mTORC1和mTORC2通路活性;mTORC1和mTORC2通路与p62间存在反馈调节机制4)在LPS引起的细胞自噬过程中,过表达p62时自噬相关蛋白Beclin-1和LC3水平升高,而转录后沉默p62,自噬相关蛋白Beclin-1和LC3水平降低;5)在LPS引起的细胞自噬中,过表达Vps34,自噬相关蛋白Beclin-1和LC3水平升高。总之,通过上述实验我们发现p62蛋白可以定位在内质网和高尔基体,这是除内质网之外,p62在内膜系统的新定位;mTORC1和mTORC2信号通路调控p62的表达,同时p62对mTORC1和mTORC2信号通路的活性具有正向调控作用,存在反馈调节机制;相互作用组分析显示有188种蛋白可能与p62具有直接或间接的相互作用关系;p62促进由LPS引起的细胞自噬,其相互作用蛋白Vps34亦具有促进作用。本文对p62蛋白的亚细胞定位,与mTORC1/2信号通路之间的相互调控关系和p62及其相互作用蛋白在LPS诱导的小鼠巨噬细胞自噬过程中发挥作用的研究结果,加深了对p62蛋白特性的了解,为进一步研究p62蛋白在LPS诱导的细胞自噬中发挥的生物学功能提供了基础数据。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q25
【图文】：

抵御毒性或蛋白酶毒性的应激反应的作用，也被认为是保护性自噬。细胞内、外的诱导自噬发生，这些信号包括氧化应激、内质网应激或营养匮乏等。另外，自噬可胞内的病原体，在维持细胞存活方面具有重要意义。自噬的许多关键性功能决定了疾病的发生发展过程中有着不可替代的作用，例如癌症、神经系统损伤、糖尿病和[2]。自噬的过程蛋白质降解途径有两种，泛素蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径。自噬溶酶体系统是膜生物发生和囊泡转运的蛋白降解途径，与泛素蛋白酶体系统明显不同。自噬的第膜囊的出现，然后是膜囊的伸长[3]；被拉长的膜，称为隔离膜/吞噬泡（isobrane/phagophore），可以吞噬部分细胞质成分，通过膜的两端融合形成双膜结构，体；自噬体的外膜随后与溶酶体膜融合，自噬体的内囊泡及其内容物被各种溶酶体解[4]（图 1.1）。

2 蛋白的功能QSTM1/p62 是一种多功能泛素化结合的接头蛋白，参与泛素蛋白酶体系统和自两种蛋白质降解过程，同时具有质核穿梭功能，在 DNA 损伤修复和氧化应激要作用。p62 作为细胞接头蛋白，是细胞内多种蛋白复合物的主要成分，其分个功能结构域，可通过与其它蛋白质的相互作用来调控不同的信号通路，包括κappa B(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)[15]，核转录因子 NF-E2 相关转ear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf2)[16]和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mamof rapamycin, mTOR)[17]等信号通路，参与细胞的生长、自噬、癌变等生理病理过噬过程中的适配蛋白，同时也调控着自噬的过程。当自噬活性减弱时，p62 蛋[18]图1.2 p62的结构域及相互作用蛋白Figure 1.2 p62 domain and interaction protein

3．p62 与自噬核细胞内高度保守的程序性调控过程，通常自噬被认为年的研究证明自噬是一个选择性的降解过程，p62 作为发挥着重要作用。p62 分子的 UBA 结构域上的 Ser407 )磷酸化，随后 UBA 结构域上的 Ser403 被酪蛋白激酶 2（1（TANK-binding kinase 1）磷酸化导致 p62 泛素化[46]，促进以通过自身寡聚化促进泛素化底物的包装，并把包装的底成过程[47]。LC3 是哺乳动物细胞中常见的自噬小体标记种调控作用，包括膜融合、自噬物的选择、自噬小体的运图 1.3 p62 在 mTORC1 活化的氨基酸信号通路中的作用模型[44] Model for the role of p62 in amino acid signaling towards mTORC1 ac

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本文编号：2752084