菠菜SpoRaf28基因克隆及其高温应答功能分析

发布时间：2020-07-12 16:49

【摘要】：非生物胁迫对植物生长有明显影响,其中高温胁迫严重影响植物生长发育和产量。研究植物高温应答分子机制对于农作物改良具有重要意义。菠菜(Spinacia oleracea L.)是耐冷不耐热的蔬菜,在我国北方广泛种植。菠菜不适合长距离运输,导致夏季南方菠菜供应不足,培育耐热菠菜品种并在南方推广种植具有重要意义。我们培育了菠菜耐热材料Sp75,并开始利用分子生物学手段研究菠菜高温应答机制。促丝裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联信号通路在植物发育与高温应答过程中都具有重要作用。该通路由逐级激活的三级激酶MAP3K、MAP2K和MAPK通过顺序磷酸化发挥功能。菠菜基因组中有35个MAP3K和5个MAP2K,其高温应答模式和相互调控关系并不清楚。本研究在全基因组范围内分析了SpoMAP3K家族的35个成员,其与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甜菜(Beta vulgaris L.)、藜麦(Chenopodium quinoa Willd)、南瓜(Cucurbita moschata L)、笋瓜(Cucurbita maxima Duch.)、黄瓜(Cucumis sativus L)等植物的MAP3K蛋白同源性较高,该蛋白的激酶结构域、磷酸化功能位点、半胱氨酸位点都较为保守。我们克隆了SpoMAP3K家族中SpoRaf28基因,其最大开放阅读框为1101bp,共编码366个氨基酸。利用烟草瞬时表达技术,对SpoRaf28进行亚细胞定位,结果显示该蛋白定位于细胞质中。荧光定量PCR分析表明,高温胁迫下在菠菜热敏感材料Sp73中SpoRaf28基因表达水平没有显著差异,而在耐热型材料Sp75中,SpoRaf28基因表达量显著上升。菠菜材料Sp75在六叶期和抽薹期SpoRaf28基因表达量在不同组织器官中表达量差异明显,两种时期均在叶片表达量最高。菠菜材料Sp75经37℃高温处理72h后,叶片明显发生萎蔫现象,SpoRaf28基因表达量呈上升趋势,但在不同盐碱(NaCl、Na_2CO_3、NaHCO_3)与重金属(CdCl_2)胁迫条件下,叶片表型无明显现象,SpoRaf28基因表达量下降,这表明SpoRaf28受到高温诱导,但是受盐和重金属胁迫抑制。37℃高温处理下,过表达SpoRaf28基因的酵母菌株和拟南芥植物的生长都受到促进,这表明SpoRaf28在高温应答过程中起正调控作用。酵母双杂交试验的结果表明SpoRaf28与SpoMAP2Ks不相互作用。我们的结果表明,SpoMAP3K家族成员SpoRaf28在菠菜高温应答信号通路中起到了正调控作用,为研究MAPK级联途径的分子调控机理提供了新的证据。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2;S636.1
【图文】：

菠菜,大肠杆菌,测序,克隆载体

利用 Primer5 设计基因全长特异性引物。以菠菜 Sp75 的 cDNA 为模板对 SpoRaf28 基因进行 PCR 扩增（图3-2），将 DNA 扩增产物进行回收，连接克隆载体，转化至大肠杆菌，将大肠杆菌菌液送生物公司测序。测序结果比对显示与基因组预期结果吻合。图 3-1 菠菜 Sp75 叶片总 RNA 凝胶电泳图谱Fig.3-1 Total RNA of Sp75 leaves28S rRNA18S rRNA

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第 3 章结果上海师范大学硕士学位论文3.2.3 SpoMAP3K 蛋白家族的系统发育分析从菠菜基因组数据库中找到菠菜 MAP3K 家族的 35 个同源蛋白。通过蛋白质序列进行系统发育树分析，如图 3-5 所示，在阴影部分有 4 个蛋白与菠菜Spo04124（SpoRaf28）最同源，菠菜 Spo04124 与 Spo10743、Spo02347、Spo16751、Spo19902 蛋白亲缘关系最近，同源性最高。

氨基酸序列,系统进化树分析,菠菜,拟南芥

293.2.4 SpoRaf28 的亲疏水性分析利用 ExPASy 数据库提供的计算亲疏水性分布的 ProtScale 工具（https://web.expasy.org/protscale/），对 SpoRaf28 蛋白的氨基酸序列进行分析，如图 3-6 可知，其中正值为疏水性，负值为亲水性，结果显示 SpoRaf28 蛋白具有明显的亲水性；结合亚细胞定位预测结果（https://rostlab.org/services/loctree3/），判断其编码蛋白可能位于细胞质中。

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