铈元素处理拟微绿球藻油脂积累机理研究

发布时间：2020-07-12 17:35

【摘要】：随着人类社会的发展,化石能源不断枯竭,能源危机日益严重,人们迫切的寻找可再生能源代替化石能源,如光能,水能,太阳能等。生物质能源作为一种新型、可再生能源备受关注,而微藻因其繁殖速度快、培养方式简单、富含大量三酰甘油(TAG)、可以进行光合作用等特点被认为是未来生物柴油工业化生产的主要原料。然而,发展以微藻为原料的生物柴油存在以下缺点:如何选育出含油量较高的藻种以及提高油脂提取效率。研究表明,微藻经稀土元素胁迫后,对其油脂含量有促进的作用。本文以铈元素作为处理因素,拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata)作为出发藻种,在f/2培养基中添加不同浓度的铈元素,测定铈元素对拟微绿球藻生物量、油脂积累,抗氧化系统以及光系统Ⅱ和油脂代谢相关基因的影响。具体结果如下:1.对尼罗红染色法检测细胞内油脂含量的染色条件优化,选择二甲基亚砜浓度、预处理温度、尼罗红染液浓度,染色时间四个条件进行单因素实验,设计正交实验,最终确定最佳染色条件为:二甲基亚砜(DMSO)浓度为20%,预处理温度35℃,尼罗红浓度为1.5μg·mL~(-1),染色时间10 min。用优化后检测方法检测胞内油脂含量为514 mg·L~(-1)。最终构建了拟微绿球藻细胞油脂含量(mg·L~(-1))与荧光值之间的线性方程。2.用铈元素处理拟微绿球藻细胞,低浓度铈元素对拟微绿球藻的生长并无影响,而高浓度的铈元素则抑制其生长。当铈元素浓度为52.6μmol·L~(-1)时,稳定期拟微绿球藻油脂含量最大,比对照高38%。通过透射电镜对细胞内铈元素进行定位,发现铈元素主要富集于液泡、内质网、细胞间隙等部位。3.在培养基中添加铈元素后,无论在指数期还是稳定期,CAT、SOD两种酶的活性以及胞内MDA含量均有所增加,表明在添加铈元素后,拟微绿球藻细胞内产生氧自由基,超氧阴离子等,影响胞内细胞器的正常功能,对细胞造成损害。随着铈元素浓度增加,指数期细胞中叶绿素a含量先增加后降低,而在稳定期则不断降低。对于光系统Ⅱ的能量转换情况,指数期时,光系统Ⅱ供体侧吸收的能量增加,热耗散增加,受体侧接受的能量降低;而在稳定期供体侧吸收的能量并无显著变化,耗散的能量降低,受体侧接收到的能量基本没有显著变化。4.将铈元素浓度为52.6μmol·L~(-1)的处理组以及对照组进行RNA-seq分析后发现,共有55609个unigenes进行了GO功能注释;通过KEGG代谢途径分析,总共25039unigenes被富集到KEGG途径,基因占比最多的代谢途径包括碳水化合物代谢(共2224各基因),氨基酸代谢(共1726个基因),脂质代谢(共1198个基因),能量代谢(共1111个基因)。之后对差异基因分析,发现调控丙酮酸脱氢酶复合体1、酰基辅酶A氧化酶、甘油激酶的基因是差异基因中与油脂代谢相关的关键基因。经real-time PCR检测后发现丙酮酸脱氢酶复合体1基因表达量上调5.26倍,酰基CoA氧化酶基因表达量下调了0.68倍,甘油激酶基因表达量上调1.14倍。通过铈元素处理拟微绿球藻,对其油脂含量、抗氧化系统、光系统Ⅱ、油脂代谢相关基因等指标检测,初步确定了铈元素对拟微绿球藻油脂合成的影响机制,从而为以拟微绿球藻作为生物柴油的原料提供理论支持。
【学位授予单位】：内蒙古科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q949.93
【图文】：

曲线,叶绿素荧光诱导动力学,曲线,电子传递

生成 P680+Pheo-。之后 Pheo-把电子传递给光系统Ⅱ，又经过一系列质体、受体的传递，最终将电子传递到了光系统Ⅰ的反应中心上（P700）。P700 功能基本与 P680 类似，主要将电子传递给铁氧还蛋白，并通过铁氧还蛋白酶生成 NADPH，用于光合碳的还原。电子传递的过程伴随着质子的传递和跨膜质子梯度的生成，并最终偶联 AT的生成。在光合机构捕获光能发生电子传递的同时，还有一部分能量以热和荧光的形式耗散掉[62]。这三者之间是互相竞争、此消彼长的关系[63]。植物细胞在充分的暗反应状态后，PSⅡ的反应中心可以达到最大的接受电子的的状态，而此时的荧光值最低处于初始相，定义为“O”。当突然出现一个强光照射暗处里后的植物时，会产生大量的初级醌受体-，但因为此时次级醌受体并不能接收电子，因此会造成大量的初级醌受体-积累，这一点由 J 点来表示[64]。当 QB 完全从 QA-接收电子后，QA 完全进入还原状态，此时的 PSⅡ完全进入关闭状态，荧光值达到最大即为 P 点。至于 I 点的出现目前还并不明确。O-J-I-P 四点即构成了叶绿素荧光诱导动力学曲线[65-66]，曲线如图所示[67]。

技术路线图,油脂,相关指标,层面

1.7 研究目的及意义本研究通过用不同浓度的铈元素胁迫处理拟微绿球藻，依靠尼罗红染色法以及分光光度计法检测其油脂含量以及生长情况。同时检测其抗氧化系统相关指标、叶绿素a 含量以及光系统Ⅱ相关指标来了解铈元素对其生理生化反应的影响，并通过透射电镜对细胞内的铈元素定位。最终将对照组和含油量最高的处理组送与测序公司进行转录组测序，获得数字基因表达谱，找到和油脂代谢的关键基因，并进行验证。从生理生化层面、基因表达层面阐明藻细胞生长、油脂积累与环境中稀土元素互作的响应机制，为通过基因工程和系统生物学调控手段提高能源微藻提高油脂产率提供理论及实验依据。1.8 技术路线图本实验技术路线图如图 1.1 所示。

浓度,含硫有机化合物,脂肪烃类,吸湿性

对染色结果的影响甲基亚砜）是一种含硫有机化合物，弱氧化剂，化沸点较高，184℃。可以溶解除石油醚之外的大部脂肪烃类化合物，具有强烈的吸湿性。适量的 D外部的染液较容易的进入细胞，对胞内的脂质充分知，当 DMSO 浓度在 0-20%间时，荧光值呈现况，当 DMSO 浓度继续增加达到 30%、40%时荧 40%时，荧光值甚至低于 0%。在 DMSO 浓度为.05）。

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