天蓝色链霉菌IclR家族转录调控蛋白SCO2832的功能初步研究
发布时间：2020-07-13 14:21
【摘要】：链霉菌是一种G+细菌,能够合成多种次级代谢产物,例如抗生素、抗肿瘤物质等。天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)作为链霉菌属中模式菌株,其基因组已于2002年完成测序,序列分析揭示了其基因组内有许多天然物质的生物合成基因集群,例如放线紫红素(Actinorhodin)简写为ACT、十一烷基灵菌红素(Undecylprodigiosin)简写为 RED、钙依赖性抗生素(Calcium-dependent antibiotic)简写为CDA等的生物合成基因簇。通过整体性调控因子进行整体调控从而合成这些天然产物,而目前这些调控机制尚不明确。IclR家族广泛分布于G+细菌中,具有多种重要的调控功能。SC02832是天蓝色链霉菌M145基因组中一个假定IclR家族蛋白,其功能至今未被阐明。本论文对天蓝色链霉菌M145假定调控蛋白SC02832功能进行了初步探索,旨在探讨这个转录调控蛋白质SC02832对天蓝色链霉菌M145生理过程的调控机制和原理。首先通过PCR-targerting方法构建敲除质粒,采用接合转移法获得缺失调控基因sco2832的突变菌株△2832。将M145与A2832进行表型分析,发现△2832的ACT、RED以及CDA的产量均有不同程度的减少。通过相对定量测定实验对M145与△2832中的ACT、RED、CDA的产量差异进行了验证。为了证明是因为缺失sco2832基因而导致了突变菌株A2832发生了表型变化,利用整合载体pMS82,携带sco2832完整编码序列和其启动子区域,回补A2832获得回补菌株C-A2832。表型分析发现回补菌株的生长发育以及次生代谢产物的生物合成情况接近M145,证明A2832的表型变化是由sco2832的缺失引起的。为了确定SC02832的调控基因群,对培养至72h的M145与A2832进行了转录组数据分析进而寻找调控蛋白SC02832所调控的基因集群。结果表明SC02832调控25 1个基因的转录,在其中与ACT、RED等生物合成相关的基因表达量显著减少,与CDA生物合成的相关基因以及和形态发育相关的多个基因簇如chp、ram、、rdl的表达也为下调。利用Realtime-PCR对部分基因的表达进行了定量分析,分析成果与转录组数据结论一致。说明SC02832对ACT、RED的生物合成是负调控机制,对CDA生产中的途径特异性激活基因sco3217(cdaR)的转录也为负调控。为进一步研究SCO2832的保守结合序列,我们使用表达载体pET22b表达载体对SCO2832进行了异源表达,获得了纯化的His-SCO2832融合蛋白。综合以上实验数据结果,本研究发现IclR家族转录调控蛋白SCO2832全局性地调控天蓝色链霉菌的生长发育与次级代谢产物ACT、RED、CDA的转录表达。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【图文】：
天蓝色链霉菌的生长周期为链霉菌的典型代表，其生长发育过程含有基生菌逡逑丝期、气生菌丝期、孢子丝期三个循环的过程［｜｜］。天蓝色链霉菌的生长周期示逡逑意图如图１－２所示，指示不同时期菌丝体的形态和位置不同。其生长周期先是逡逑伸出基生菌丝，然后分化成具有繁殖功能的气生菌丝，随后在恶劣条件下形成逡逑孢子。当孢子摆脱恶劣的环境并碰到合适的条件就会萌发然后生出根管，其根逡逑２逡逑
操纵子的转录＝逡逑目前有５种可用的丨ｃｌＲ蛋白质三维结构，其中包括来自海栖热抱菌逡逑ＴＭ００６５的全蛋白质如图１－４所示，两种乙醛酸调节蛋白的效应结合结构域，但逡逑获得的所有结构都没有结合的ＤＮＡ和效应子。天蓝色链球菌和灰色链霉菌的逡逑■ｗｇｊ突变体能够形成明显正常的营养隔膜，但其在仍在孢子形成中产生缺陷，逡逑６逡逑
ＬＢ培养基（Ａｍｐ、Ｋｍ、Ｃｍｌ、Ａｐｒ）内继续辉育，直至其液体的ＯＤ６00值到达０．６逡逑上下。然后把培养液倒入５０ｍＬＥＰ管内，５０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ后回收菌体，使逡逑用不添加任何抗生素的ＬＢ漂洗沉淀后，倒掉上清液，加５００逦ＬＢ培养基重新逡逑悬浮并使用移液器吹打均匀放置备用。逡逑吸取含有数量约１０６个Ｍ１４５孢子的保藏液，１３０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ，去掉甘逡逑油溶液，使用２ｘＹＴ培养基对孢子进行２次洗涤，将其悬浮在５００邋ｐＬ２ｘＹＴ培养逡逑基中，先用５０°Ｃ热激１０邋ｍｉｎ，再使用冷水流动或者冰浴到常温。将制备好的５００逡逑ＨＬ感受态悬液以及５００邋ｐＬ己萌发的链霉菌悬液混合到２邋ｍＬＥＰ管中，不停地混逡逑合均匀，再涂布到含２邋Ｍｍ邋Ｍｇ２＊的ＭＳ－Ｇ培养基表面，在超净工作台中送风，表逡逑面干燥后把其翻转过来在３０°Ｃ恒温箱中孵育１４－１８ｈ，进行覆盖实验。取１邋ｍＬ水逡逑溶液（Ａｐｒ、Ｎａｄｉ）均匀覆盖在长有菌体的培养基上方，超净工作台中垂直送风逡逑３０邋ｍｉｎ以上再将其翻转并在３（ＴＣ培养箱内继续孵育２－３邋ｄ，双交换片段过程像图逡逑２－１示意，观察平板表面是否产生接合转移单克隆。逡逑Ｅ．ｃｏｌｉ邋ＥＴ１２５６７邋■＇邋ｐＵＺ８Ｑ０２！邋ｃｏｓｍｉｄ逡逑
本文编号：2753575
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【图文】：
天蓝色链霉菌的生长周期为链霉菌的典型代表，其生长发育过程含有基生菌逡逑丝期、气生菌丝期、孢子丝期三个循环的过程［｜｜］。天蓝色链霉菌的生长周期示逡逑意图如图１－２所示，指示不同时期菌丝体的形态和位置不同。其生长周期先是逡逑伸出基生菌丝，然后分化成具有繁殖功能的气生菌丝，随后在恶劣条件下形成逡逑孢子。当孢子摆脱恶劣的环境并碰到合适的条件就会萌发然后生出根管，其根逡逑２逡逑
操纵子的转录＝逡逑目前有５种可用的丨ｃｌＲ蛋白质三维结构，其中包括来自海栖热抱菌逡逑ＴＭ００６５的全蛋白质如图１－４所示，两种乙醛酸调节蛋白的效应结合结构域，但逡逑获得的所有结构都没有结合的ＤＮＡ和效应子。天蓝色链球菌和灰色链霉菌的逡逑■ｗｇｊ突变体能够形成明显正常的营养隔膜，但其在仍在孢子形成中产生缺陷，逡逑６逡逑
ＬＢ培养基（Ａｍｐ、Ｋｍ、Ｃｍｌ、Ａｐｒ）内继续辉育，直至其液体的ＯＤ６00值到达０．６逡逑上下。然后把培养液倒入５０ｍＬＥＰ管内，５０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ后回收菌体，使逡逑用不添加任何抗生素的ＬＢ漂洗沉淀后，倒掉上清液，加５００逦ＬＢ培养基重新逡逑悬浮并使用移液器吹打均匀放置备用。逡逑吸取含有数量约１０６个Ｍ１４５孢子的保藏液，１３０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ，去掉甘逡逑油溶液，使用２ｘＹＴ培养基对孢子进行２次洗涤，将其悬浮在５００邋ｐＬ２ｘＹＴ培养逡逑基中，先用５０°Ｃ热激１０邋ｍｉｎ，再使用冷水流动或者冰浴到常温。将制备好的５００逡逑ＨＬ感受态悬液以及５００邋ｐＬ己萌发的链霉菌悬液混合到２邋ｍＬＥＰ管中，不停地混逡逑合均匀，再涂布到含２邋Ｍｍ邋Ｍｇ２＊的ＭＳ－Ｇ培养基表面，在超净工作台中送风，表逡逑面干燥后把其翻转过来在３０°Ｃ恒温箱中孵育１４－１８ｈ，进行覆盖实验。取１邋ｍＬ水逡逑溶液（Ａｐｒ、Ｎａｄｉ）均匀覆盖在长有菌体的培养基上方，超净工作台中垂直送风逡逑３０邋ｍｉｎ以上再将其翻转并在３（ＴＣ培养箱内继续孵育２－３邋ｄ，双交换片段过程像图逡逑２－１示意，观察平板表面是否产生接合转移单克隆。逡逑Ｅ．ｃｏｌｉ邋ＥＴ１２５６７邋■＇邋ｐＵＺ８Ｑ０２！邋ｃｏｓｍｉｄ逡逑
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1 张紫茜;天蓝色链霉菌IclR家族转录调控蛋白SCO2832的功能初步研究[D];山东大学;2019年
本文编号：2753575
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