毕赤氏酵母中高效表达人血清白蛋白及基因编辑新技术的研究

发布时间：2020-07-15 22:39

【摘要】：人血清白蛋白是临床上具有重要应用的蛋白,但重组人血清白蛋白未能工业化生产,严重限制了它在临床上的供应。本课题开展人血清白蛋白高效表达和相关的毕赤酵母中基因编辑技术的研究具有重要的应用前景。本文首先将密码子优化后的人血清白蛋白基因通过同源重组技术,整合到毕赤酵母基因组的HIS4位点,构建了能表达重组人血清白蛋白的毕赤酵母菌株,初步优化了表达条件后摇瓶发酵产量在0.52 g/L。为能够利用代谢工程技术促进重组人血清白蛋白的工业化生产,进一步开展了建立高效的CRISPR/Cas9基因编辑系统的研究,以便后续能有效地对毕赤酵母进行系统改造。本文从质粒构建出发,在比较了五种毕赤酵母ARSs(PARS1,panARS,mitoARS,PpARS2和ScARS)的质粒转化效率、稳定性和拷贝数后,构建了 RNA pol Ⅲ启动子控制下的CRISPR/Cas9系统。这一新系统与以PARS 1为复制子的系统相比,编辑效率提高10倍,高达80%。本文继续将Cas9基因整合到基因组上,发现无论是RNA pol II启动子还是RNA pol Ⅲ启动子,只要使用毕赤酵母本身的启动子来表达sgRNA均能有较高的编辑效率。最终在毕赤酵母中,构建了基因敲除效率在80%以上而且基因整合效率在70%以上的CRISPR/Cas9基因组编辑新技术。总之,本论文构建成功了一个重组表达生产人血清白蛋白的毕赤酵母基因工程菌,并且进一步建立了更高效的CRISPR/Cas9基因组编辑新技术。这一更高效的基因组编辑技术的建立,将大大加快毕赤酵母基因组改造的效率,从而有利于提高包括人血清白蛋白在内的多种重要医用蛋白质的高效和高质量生产。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【图文】：

人血清白蛋白（ＨｕｍａｎＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ，ＨＳＡ）是人类血装中含量最丰富的蛋逡逑白质，在血浆中浓度为３５－５０邋ｇ／ｌ［１２］，约占血浆总蛋白的６０％［１３］。ＨＳＡ是由５８５逡逑个氨基酸组成的单链球状不对称心形蛋白（图１－１），其分子量为６６．５ｋＤ，分子中逡逑含有３５个半肮氨酸，形成了邋１７个二硫键。早在１９７５年，Ｍｅｌｏｕｎ等人就已经确逡逑定了邋ＨＳＡ完整的氨基酸序列［１４］，而当时由于技术限制，ＨＳＡ的二级结构及三逡逑级结构并未确定。逡逑图１－１邋ＨＳＡ蛋白结构逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＨＳＡ逡逑直至１９８９年，为了解ＨＳＡ的结构，Ｃａｒｔｅｒ等人首次在６．０邋Ａ分辨率下对人逡逑血清白蛋白的三维结构进行了解析，并于１９９２年提供了更高分辨率（２．８Ａ）条逡逑件下的结构解析结果［１５１。随后，随着蛋白分质结构分析技术的发展，在１９９９年，逡逑Ｓｕｇｉｏ团队在２．５邋Ａ的分辨率下对人血清白蛋白的分子结构进行了进一步分析［１３；逡逑｜６］。通过以上研究发现，ＨＳＡ是一种ａ－螺旋程度较高的蛋白，其二级结构中含有逡逑２逡逑

逡逑６７％的ａ－螺旋，此外还有２３％的延伸链和１０％的ｐ－转角结构，其结构如图１－１所逡逑示。完整的ＨＳＡ由三个结构相似的结构域构成，这三个结构域都是通过ａ－螺旋逡逑形成，分别为１－１９５氨基酸组成的结构域Ｉ，１９６－３８３氨基酸组成的结构域ＩＩ，以逡逑及３８４－５８５氨基酸组成的结构域ＩＩＩ。每个结构域包含１０个反向平行螺旋结构，逡逑可以分为ａ和ｂ两个子域，其中子域ａ含有６个螺旋，子域ｂ包含４个螺旋［１＾逡逑１９ｌＨＳＡ的球状心形结构使其具有较好的弹性，但是当与其他分子结合时，其形逡逑状会根据结合的分子不同而产生不同的变化，例如白蛋白与药物结合后的结构改逡逑变能够影响药物在体内的分布和清除，因此ＨＳＡ在临床治疗方面具有重要作用。逡逑ＨＳＡ中一共有３５个Ｃｙｓ

因此这两种酶都能促进ｈｒ的效率。逡逑除ＨＲ外，机体内还存在另外一种重要的ＤＮＡ损伤修复方式，那便是非同逡逑源末端连接（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ｅｎｄ邋ｊｏｉｎｉｎｇ，邋ＮＨＥＪ），修复过程如图１－３所示。参逡逑ＮＨＥＪ过程的一种重要的蛋白是Ｋｕ蛋白，该蛋白是Ｋｕ７０和Ｋｕ８０的异二聚体，逡逑用于识别ＤＳＢ。当Ｋｕ蛋白识别到ＤＳＢ后，便会结合到断裂末端，召集ＤＮＡ－逡逑ＰＫｃｓ邋（ＤＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅ邋ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ｓｕｂｕｎｉｔ）通过自淲酸化激活邋ＮＨＥＪ逡逑修复，而后利用Ａｒｔｅｍｉｓ重组酶加工ＤＮＡ末端，最后通过ＤＮＡ连接酶将处理完逡逑的末端进行连接，达到修复ＤＮＡ链断裂的目的Ｗ１。与同源重组不同，非同源末逡逑端连接不需要同源模板的参与，利用该过程对ＤＳＢ进行修复更为简便，但是也逡逑更容易导致基因的插入、缺失和点突变等错误修复。逡逑？＇－逦５，Ｈ邋Ｔｉｒｇｃｔ邋ｓｅｎｅ邋３，邋Ｈ邋逦逡逑逦ＨＲ逦邋逦ＮＨＥＪ逦逡逑Ｒａｎｄｏｍ邋ｇｅｎｅ邋ｌｏｃｕｓ逡逑逦邋５＞Ｈ邋Ｔａｒｊ！ｅｔＲｅｎｅ邋３＊Ｈ逦—逡逑ｒ２邋ｘ邋ｘ邋ｓ

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