Sirt5催化组蛋白去琥珀酰化修饰的分子机制研究和金黄色葡萄球菌表面蛋白SdrE的结构与功能研究

发布时间：2020-07-16 13:44

【摘要】：组蛋白的翻译后修饰是一种重要的表观遗传学调控方式,多发生于组蛋白的N端柔性区,包括甲基化、乙酰化、磷酸化等修饰。组蛋白的翻译后修饰及其多种组合方式,构成了特定的组蛋白密码,包含着特定的生物学信息。组蛋白密码经由特殊的效应分子(reader)解码,触发下游一系列生物学事件的发生,进而参与多种生物学过程的调控。同时,组蛋白的修饰水平受到特定修饰酶(writer)与去修饰酶(eraser)的动态调控。组蛋白的乙酰化修饰是研究得较为深入的一种酰基化修饰。除此之外,随着近年来质谱技术的发展,包括丙酰化、丁酰化、琥珀酰化、丙二酰化、丁二酰化、羟异丁基化、β-羟基丁酰化、巴豆酰化等在内的一些新型的酰基化修饰,逐渐被鉴定出来。组蛋白的酰基化修饰受到酰基转移酶和去酰基化酶的共同调节。其中,sirtuin家族蛋白(Sirtl-7)作为一类重要的去酰基化酶,参与调控组蛋白酰基化修饰的去除。其家族成员Sirt5主要定位于线粒体,也被报道在核内有定位。与其他sirtuin蛋白相比,Sirt5的去乙酰化活性较弱,但能够特异性地识别并催化赖氨酸上带负电荷的修饰基团的移除,发挥去琥珀酰化、去丙二酰化和去戊二憸化修饰的功能。在本论文的第一部分,我们针对人源去酰基化酶Sirt5对不同的组蛋白玻珀酰化修饰位点的选择偏好性展开了一系列生化与结构生物学的研究。通过光交联pull down及label-free质谱方法,我们鉴定了与组蛋白H3K122琥珀酰化小肽(H3K122su)结合的蛋白Sirt5。进一步的酶活实验表明,Sirt5可以移除H3K122琥珀酰化小肽的修饰基团。此外,Sirt5还被报道可以在体外催化H3K9su的去琥珀酰化反应,暗示其组蛋白去玻珀酰化酶的活性。为探究Sirt5移除不同位点的组蛋白琥珀酰化修饰的分子机制,我们合成了包含已被鉴定的14种琥珀酰化修饰位点的组蛋白小肽,并检测了 Sirt5对小肽的去琥珀酰化酶活性。结果显示,Sirt5可移除多个组蛋白位点的琥珀酰化修饰,但对H4K31su位点没有活性。为进一步探究Sirt5对底物的识别机制,我们解析了 Sirt5分别与H3K122su、H2AK95su、H2BK120su以及H4K91su小肽的复合物晶体结构,并通过序列比对、结构分析和突变体的酶活实验证明,Sirt5不能移除+1位为脯氨酸的组蛋白琥珀酰化位点,阐明了 Sir5作为一种广泛但具有序列选择性的组蛋白去琥珀酰化酶发挥功能的分子机制。此外,免疫荧光实验和体内酶活实验表明,Sirt5蛋白可定位于HeLa细胞核,且具有内源性去组蛋白琥珀酰化修饰的能力。这一结果进一步暗示了 Sirt5作为一种组蛋白去琥珀酰化酶,通过调控组蛋白琥珀酰化水平发挥重要的生物学功能。本论文的第二部分为金黄色葡萄球菌表面蛋白SdrE的结构与功能研究。SdrE可通过结合宿主的补体因子H(FH),发挥免疫逃逸功能。我们通过GST pull down及ITC实验确定了 FH与SdrE的最短结合区域,并测定了二者的亲和力。我们解析了 SdrE的配体结合结构域N2N3(SdrE-N2N3)及其与FH多肽复合物的晶体结构,确定了 FH在该结构域上的结合位点,并通过定点突变进一步获得了参与结合的关键氨基酸残基。基于晶体结构分析,我们证实了 SdrE在配体结合时存在着变构效应,且提出了一个新奇的“CDLL”配体结合模型,为金黄色葡萄球菌依赖SdrE实现免疫逃逸的分子机制做出了解释。本论文的第三部分为金黄色葡萄球菌核酸内切酶RNase HII的结构与功能研究。RNaseHII能够切割DNA-RNA杂交链,参与RNA错配、冈崎片段的移除、核酸代谢、DNA损伤修复等多种生物学过程。我们解析了金黄色葡萄球菌RNase HII的二聚体晶体结构,通过多角度静态光散射和小角散射实验测定其在溶液中的聚集状态,并通过电子自旋共振进一步佐证其二聚形式。生化实验显示,二体形式的RNase HII仍然具有底物催化活性,暗示其聚集状态具有特殊的生理学意义。
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q75
【图文】：

章Ｓｉｒｔ５催化组蛋白去琥珀酰化修饰的分子机制同修饰底物的偏好性。Ｓｉｒｔ５能够选择地水解小肽／琥珀酰化而非乙酰化修饰基团，其催化机制与其类似，都是利用ＮＡＤ＋作为辅助因子，生成ＮＡ去修饰后的底物［２３４］。逡逑ｉｒｔ５与Ｈ３Ｋ９琥珀酰化修饰小肽及ＮＡＤ＋的复合物基与Ｓｉｒｔ５底物口袋中的Ｔｙｒｌ０２和Ａｒｇｌ０５发生在ＩＩＩ类ｓｉｒｔｕｉｎ蛋白中保守的氨基酸的突变将导降低，表明二者对底物结合的重要性［２３４］。逡逑

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ｍ／ｉ逡逑ＡＬＤＩ－ＴｏＦ质谱检测Ｓｉｒｔ５对Ｈ３Ｋ１２２ｓｕ小肽的组未加Ｓｉｒｔ５。小肽的质谱谱峰质荷比ｍ／ｚ以对组蛋白琥珀酰化赖氨酸具有广泛的ｉｒｔ５是否对组蛋白琥珀酰化修饰位点的移除具１４种包括Ｈ３Ｋ９和所有己知的人源组蛋白琥珀酰化修饰小肽（表１．３．２）。通过Ｓｉｒｔ５酶活实验，Ｓｉｒｔ５对不同琥珀酰化修饰的组蛋白小肽的催化明，在１４种合成的小肽中，仅有Ｈ４Ｋ３１ｓｕ小化去除。逡逑

本文编号：2758073